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Detección de ingredientes genéticamente modificados en base a proteínas

Ingredientes genéticamente modificados El uso de organismos genéticamente modificados (GMOs, por sus siglas en inglés) en los productos alimenticios está regulado en muchos países alrededor del mundo. Las regulaciones normalmente contienen reglas de etiquetado si el contenido de GMO está por arriba de cierto umbral. Para poder cumplir con estas regulaciones, las herramientas analíticas deben estar disponibles para monitorear y verificar la presencia y cantidad de GMOs en cultivos agrícolas y en productos derivados de los mismos. Estos métodos detectan, identifican y cuantifican ya sea el DNA introducido o las proteínas expresadas en el material transgénico.

En consecuencia, varios laboratorios han desarrollado métodos basados ya sea en la detección del DNA utilizando la técnica de reacción en cadena de polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés), o basados en la detección de proteína utilizando ensayos inmunosorbentes ligados a enzima (ELISA, por sus siglas en inglés). Estos métodos, sin embargo, varían en su confiabilidad, robustez y reproducibilidad, costo, complejidad y velocidad.

Especialmente en Europa, la técnica PCR es utilizada ampliamente, mientras que en Estados Unidos se prefieren los métodos basados en proteínas. Aunque los métodos basados en PCR se conocen por su alta sensibilidad, el uso de métodos basados en proteínas es la mejor opción en algunos casos.

 

Cultivos genéticamente modificados en alimentos

El primer producto genéticamente modificado (GM) para uso en alimentos que fue aprobado para uso comercial en un país industrializado fue el tomate FlavrSavrTM en mayo de 1994. Desde entonces, la cantidad de cultivos GM se ha incrementado significativamente. Actualmente, más de 80 diferentes plantas GM están disponibles comercialmente para uso en alimentos a nivel mundial.

Los nuevos rasgos introducidos son diversos y proporcionan una cierta ventaja, o combinación de ventajas, al cultivo. El rasgo dominante utilizado en la actualidad es la tolerancia a herbicida por expresión de una forma modificada de la enzima de planta 5-enolpiruvilshikimate-3-fosfato-sintetasa (EPSPS). Cuando el herbicida Roundup® es aplicado, el compuesto activo glifosato se unirá a la forma nativa de EPSPS; esta unión resulta en una inactivación de la enzima, lo cual es esencial en la ruta shikimate. Como resultado la producción de aminoácidos aromáticos y otros compuestos aromáticos es inhibida y la planta muere. Debido a una ligera modificación en la enzima EPSPS, el glifosato no puede unirse a ella y en consecuencia la planta puede sobrevivir la aplicación inhibidora del herbicida.

El gen responsable para la producción de esta enzima EPSPS modificada en plantas ha sido aislado de la cepa CP4 en la bacteria común del suelo Agrobacterium tumefaciens y ha sido introducido por lo menos a soya, maíz, canola, algodón, alfalfa, trigo y betabel.

El segundo rasgo más introducido es resistencia a los insectos debida a proteínas cry, que son toxinas. El gen responsable de esta resistencia a insectos se deriva de la bacteria Bacillus thuringiensis. Las proteínas tóxicas actúan uniéndose selectivamente a receptores de proteínas en las células epiteliales de las entrañas larvarias de las especies de insecto susceptibles. Luego de la unión, se forman canales ión, llevando a la pérdida de ATP celular y la muerte del insecto. Su especificidad de acción puede ser directamente atribuida a la presencia de receptores de proteína específicos en los insectos objetivo (diana o target): cry1ab es letal solamente cuando es comido por la larva de los insectos lepidópteros como palomillas y mariposas, mientras que la proteína cry3a es insecticida solamente cuando es comida por la larva de insectos coleópteros como el escarabajo de la papa de Colorado y el gusano de harina amarillo.

Otras nuevas proteínas incluyen la enzima PAT (fosfinotiricin-N-acetiltransferasa), la cual convierte L-fosfinotiricin (PPT), el componente activo en glufosinato-amonio, a una forma inactiva. El gen responsable de la producción de PAT ha sido aislado del actinomiceto común del suelo Streptomyces viridochromogenes.

En resumen, los rasgos introducidos generalmente en los cultivos genéticamente modificados incluyen composición de aminoácidos (maíz), composición de ácidos grasos (soya, canola), restauración de fertilidad (canola), tolerancia a herbicidas (soya, algodón, canola, betabel, alfalfa, trigo, maíz, clavel, linaza, tabaco, achicoria, arroz y otros), resistencia a insectos (maíz, algodón, tomate, papa), esterilidad masculina (canola, achicoria, maíz), mutaciones (canola, girasol, lenteja, arroz, trigo, maíz), reducción de nicotina (tabaco), retraso de maduración (clavel, tomate, melón) y resistencia a virus (papa, papaya, calabaza).

 

Métodos de detección basados en proteínas

La mayoría de los métodos de detección de proteínas está basada en inmunoensayos, los cuales dependen de la interacción entre un anticuerpo y su antígeno. Un anticuerpo es una proteína utilizada por el sistema inmune para identificar y neutralizar objetos externos como bacterias y virus. Cada anticuerpo reconoce un antígeno específico lo que permite la producción del anticuerpo. El anticuerpo tiene una forma de Y, y cada mitad del extremo bifurcado consiste de un dominio variable que puede unirse muy fuertemente con su antígeno. Debido a esta fuerte interacción, los inmunoensayos son altamente específicos y en general las muestras requieren solamente una preparación simple antes del análisis. En el caso de detección de GM, la proteína codificada por el gen recientemente introducido actúa como el antígeno.

El factor más importante para el éxito de la detección inmunológica es la disponibilidad de anticuerpos de alta afinidad dirigidos hacia la proteína a ser detectada. Los anticuerpos pueden ser policlonales (producidos en animales) o monoclonales (producidos por cultivo celular). Los anticuerpos policlonales son heterogéneos, lo que significa que están formados por diferentes clases de anticuerpos, todos específicos para proteínas diferentes. Los anticuerpos monoclonales son homogéneos y por tanto son específicos para un antígeno. La selección de anticuerpos monoclonales o policlonales depende de la cantidad y especificidad de los anticuerpos requeridos y de las limitaciones de costo.

El éxito de los inmunoensayos también depende de la expresión activa del nuevo gen introducido en el tejido a ser analizado y de las características de las proteínas objetivo. Estas deben cumplir ciertos requerimientos relativos a tamaño, hidrofobicidad y estructura terciaria.

Un tercer criterio en el diseño y desarrollo de inmunoensayos es el formato del ensayo. En general existen 2 formatos: ensayos competitivos y ensayos sándwich. En el ensayo competitivo, el analito desconocido y una cantidad conocida de un marcador compiten por los sitios de unión del anticuerpo. La cantidad de analito desconocido presente en la muestra determina la cantidad de marcador que se une al anticuerpo. Los ensayos sándwich –también llamados ensayos de exceso de reactivo o ensayos de 2 sitios- están caracterizados por una estructura “sándwich” formada entre el analito y los anticuerpos. Un primer anticuerpo inmovilizado (“anticuerpo de captura”) se unirá al analito presente en la muestra. Estos complejos capturarán un segundo anticuerpo etiquetado (“anticuerpo detector”). Casi siempre un ensayo sándwich es preferible a uno competitivo.

 

Western Blot

El Western blot (o ensayo Western) es un método altamente específico que proporciona resultados cualitativos adecuados para determinar si una muestra contiene la proteína objetivo por abajo o por arriba de un nivel umbral predeterminado. Es particularmente útil para el análisis de proteínas insolubles. Dado que este método es laborioso, se prefiere para propósitos de investigación más que para los análisis de rutina.

Las muestras a ser analizadas son sujetas primero a un procedimiento de extracción, seguido por la solubilización de las proteínas extraídas en detergentes y agentes reductores. Las proteínas son entonces separadas por sodio-dodecil-sulfato (SDS)-electroforesis en gel de poliacrilamida, procedimiento conocido como SDS-PAGE.

Las condiciones de desnaturalización durante la electroforesis eliminan los problemas de solubilización, agregación y coprecipitación de la proteína objetivo con otras proteínas. Las proteínas son transferidas e inmovilizadas en una membrana, usualmente nitrocelulosa, donde retienen el mismo patrón de separación que tenían en el gel. La membrana es luego sumergida en una solución conteniendo un anticuerpo que específicamente reconoce la proteína objetivo.

Finalmente, el anticuerpo unido es teñido con Ponceau, nitrato de plata o Coomassie, o con un reactivo inmunológico secundario, el cual cataliza una reacción de color. La intensidad del color desarrollado en la membrana es proporcional a la cantidad de proteína detectada por el anticuerpo y por tanto la cantidad de proteína GM en la muestra.

 

ELISA

El ensayo inmunosorbente ligado a enzima (ELISA) es el tipo de inmunoensayo más común. Comprende cualquier inmunoensayo enzimático involucrando un inmunoreactivo enzimático etiquetado (antígeno o anticuerpo) y un inmunosorbente (antígeno o anticuerpo unido a su soporte sólido). De manera que existen variantes del método ELISA, con el ensayo sándwich siendo el más ampliamente utilizado y el tipo más flexible de ELISA. Las pruebas para detectar proteínas GM en alimentos, basadas en juegos de ELISA comercialmente disponibles, son principalmente ensayos sándwich, aunque algunos son ELISAs competitivos.

Para el ELISA sándwich, anticuerpos específicos para la proteína objetivo son unidos a la superficie de, típicamente, una placa de microtitulación. Cuando la solución que contiene el material de prueba es agregada el anticuerpo trabajará como una molécula de captura para la proteína objetivo. Luego de un periodo de incubación, una etapa de lavado remueve todos los componentes no unidos. Entonces un segundo anticuerpo, químicamente unido a una enzima que cataliza una reacción de color, es adicionado. Si la proteína objetivo está presente, el segundo anticuerpo etiquetado se unirá a ella y el anticuerpo etiquetado sin unir es lavado. El sustrato de la enzima es entonces adicionado para obtener un producto colorido. La intensidad de la señal producida es proporcional a la cantidad de proteína objetivo presente.

En un ELISA competitivo, los depósitos de la placa son cubiertos con la proteína objetivo. Una solución conteniendo un número limitado del primer anticuerpo junto con la muestra de prueba es adicionada. Ocurre entonces una competencia por el primer anticuerpo entre la proteína objetivo en la muestra y la proteína objetivo que cubre los depósitos. Los anticuerpos que no están unidos a los antígenos unidos a las paredes serán lavados. Un segundo complejo anticuerpo-enzima es entonces agregado, que específicamente se une al complejo antígeno-anticuerpo. Luego de una segunda etapa de lavado, se adiciona el sustrato de la enzima resultando en la producción de color. Para el ensayo competitivo, la intensidad del color es inversamente proporcional a la concentración de la proteína GM en la muestra.

La intensidad de color (densidad óptica, OD) es medida con un espectrofotómetro en la longitud de onda apropiada. Al comparar la densidad óptica de las muestras con el valor del control negativo (conocido por ser libre del analito objetivo), puede ser establecido si la muestra contiene proteínas GM o no.

Algunos juegos comerciales de placa ELISA incluyen calibradores (concentraciones conocidas del analito conocido en solución) y un control negativo. Estos estándares son corridos concurrentemente con cada juego de muestra y permiten que se establezca una curva estándar. Al utilizar el espectrofotómetro para todas las muestras y todos los estándares al mismo tiempo, se puede realizar una interpretación cuantitativa. El usuario puede luego calcular la concentración de proteína en la muestra a partir de la curva estándar.

Los juegos de prueba ELISA proporcionan resultados cuantitativos en horas, con límites de detección algunas veces por debajo de 0.1 % GMO. Una interpretación semicuantitativa puede hacerse al comparar el color de la muestra contra los estándares sin el uso de un espectrofotómetro y determinar el rango de concentración de la muestra.

 

Tiras de flujo lateral

La tira de flujo lateral es una variación de ELISA que utiliza tiras en lugar de placas de microtitulación. La tira de prueba de flujo lateral es colocada en un vial Eppendorf conteniendo la solución de prueba. La muestra migra hacia arriba en la tira por acción capilar; a medida que sube por la tira, la muestra pasa por una zona que contiene anticuerpos móviles, usualmente etiquetados con oro coloidal. Este anticuerpo etiquetado se une a la proteína objetivo, si está presente en la muestra.

El complejo anticuerpo-proteína entonces continúa moviéndose hacia arriba en la tira a través de una membrana porosa que contiene 2 zonas de captura. La primera zona de captura con anticuerpos inmovilizados se una al complejo anticuerpo-proteína, y el oro se vuelve visible como una línea roja. La segunda zona de captura actúa como una zona de control y contiene anticuerpos específicos para los anticuerpos sin tratar unidos al reactivo de color. Si no hay proteína GM objetivo presente, solamente aparecerá una línea en la zona de control. Un resultado es positivo cuando tanto la línea de control como la línea que indica la presencia de la proteína objetivo cambian de color.

 

Otros métodos

Otro formato de inmunoensayos utiliza cuentas magnéticas como una superficie sólida. El principio es el mismo que el del formato ELISA, con las partículas magnéticas recubiertas con anticuerpos de captura y la reacción siendo realizada en un tubo de ensayo. La proteína objetivo, unida a las partículas magnéticas, puede ser separada utilizando un magneto. Las ventajas incluyen una cinética superior, pues las partículas son libres para moverse en la solución de reacción, y una mayor precisión, debido a la uniformidad de las partículas.

Una novedad reciente en los ensayos basados en proteínas es la tecnología de alto rendimiento, que ha recibido mucha atención en los últimos años. El alto rendimiento es obtenido mediante el uso de miniaturización e instrumentos microfluídicos de alta sensibilidad. Aunque se emplean volúmenes muy pequeños, la técnica es confiable comparada con los inmunoensayos tradicionales. El instrumento consiste de una superficie plana, usualmente cristal o silicón, sobre el cual se depositan bandas angostas de antígeno. De forma perpendicular a estas bandas, se grava un segundo juego de líneas. Cuando las proteínas diluidas fluyen a través de este segundo juego de canales, inducidas por fuerzas capilares, éstas se unen con su antígeno específico, y aparece un patrón mosaico de pequeñísimos cuadrados. Este puede ser analizado utilizando microscopía de fluorescencia.

Las ventajas de esta técnica son numerosas. Una muestra puede ser analizada para varias proteínas en una sola prueba, y varios ensayos pueden realizarse simultáneamente. La cantidad de muestra requerida es reducida al rango de nanolitros, reduciendo así el tiempo para realizar el análisis. Adicionalmente esta técnica es muy apropiada para la automatización. Por el otro lado, el equipo necesario es costoso y se requiere personal capacitado para el análisis de los resultados. Por lo tanto, esta técnica no se utiliza con frecuencia en análisis de rutina de muestras de alimentos.

 

Ventajas de los métodos de detección basados en proteínas

Los organismos genéticamente modificados en los alimentos pueden ser detectados en base del genoma alterado, por análisis del DNA, o en base a una proteína nueva. Los ensayos basados en proteína comprenden un grupo grande y diverso de ensayos. Gracias a sus características de desempeño inherentes a la tecnología, son muy exitosas desde el punto de vista comercial. La fuerte interacción entre el anticuerpo y el antígeno se traduce en ensayos de alta sensibilidad, y la especificidad del anticuerpo minimiza la preparación de la muestra. Su costo, facilidad de uso y formato de prueba flexible han resultado en su utilización a gran escala en mercados muy diversos. El costo por prueba de un inmunoensayo, comparado con otros métodos analíticos, es bajo y existen varios formatos de prueba que requieren poco o nulo entrenamiento para ejecutarse.

Las pruebas “tira” de una etapa pueden ser realizadas por personal sin entrenamiento y proporcionan resultados si/no en minutos. El tiempo para resultado (o tiempo de vuelta) puede ser uno de los atributos más críticos de un método de prueba en aplicaciones donde un gran lote de material debe ser analizado antes de integrarse a otros lotes o proceder a la siguiente etapa de un proceso. Para pruebas en sitio la prueba de flujo lateral es generalmente la solución con mejor costo-beneficio.

Los inmunoensayos pueden rendir resultados cuantitativos en aproximadamente una hora, o pueden ser incorporados en instrumentos completamente automatizados capaces de correr cientos de muestras por hora. La cuantificación de proteínas es más fácil que la cuantificación de DNA si uno mira en la unidad de expresión de los niveles de GMO. Los resultados cuantitativos de los análisis de proteínas son expresados en base peso/peso (concentraciones molares), mientras que aquellos de los ensayos basados en DNA representan equivalentes del genoma. La influencia de los números de copia de un gen hace la cuantificación por DNA más compleja y los resultados más inciertos.

 

Limitaciones de los métodos basados en proteína para la detección de GMOs en alimentos

A pesar de las ventajas que ofrecen los métodos basados en proteínas, deben considerarse algunas desventajas en su aplicación para la detección de GMOs.

Una de las dificultades de un sistema de inmunoensayo es experimentada en el principio. Generar un anticuerpo específico contra un antígeno de interés puede ser un proceso difícil y laborioso que requiere muchas habilidades y bastante experiencia. Aquí es donde el uso de tecnología recombinante de anticuerpos podría ofrecer beneficios; utilizando esta técnica facilitaría la selección de anticuerpos con propiedades raras y la manipulación de las características de anticuerpos existentes. Una vez que un anticuerpo específico (monoclonal o policlonal) con gran afinidad por su proteína objetivo es generado, la estandarización cuidadosa y pruebas para reactividad cruzada inesperada deben realizarse. Sin embargo, una vez establecidos, la flexibilidad y el tiempo de vuelta para los sistemas de inmunoensayo son excelentes.

El ensayo ELISA puede ser unas 100 veces menos sensible que el método PCR. Esta menor sensibilidad no es una desventaja automática porque un resultado falso-positivo de un contaminante menor es menos factible de ocurrir. Dado que la unión entre anticuerpo y antígeno está basada en la estructura nativa del objetivo, cualquier cambio conformacional en el epítope del antígeno vuelve el ensayo inefectivo. El procesamiento de alimentos, como el calentamiento o exposición a ácidos o álcalis fuertes, puede causar este cambio conformacional, por lo cual la detección de la proteína ya no sería posible. Otras etapas del procesamiento, sin embargo, tales como la molienda, no tienen una influencia en la estructura de una proteína y por tanto no afectan la efectividad del ensayo, a menos que el proceso de molienda derive en el calentamiento del producto. Para solucionar este problema, algunos anticuerpos han sido desarrollados para reconocer una proteína en su forma desdoblada y pueden por tanto ser utilizados para la detección de GMOs en alimentos altamente procesados.

No obstante, la sensibilidad de las proteínas a la desnaturalización por el procesamiento, limita la aplicación de inmunoensayos a granos, materiales crudos y alimentos frescos y sin procesar. Adicionalmente, la exactitud y precisión del ensayo pueden ser afectadas por sustancias presentes en las matrices del alimento, tales como surfactantes, compuestos fenólicos, ácidos grasos, fosfatasas endógenas o enzimas que pueden inhibir la interacción antígeno-anticuerpo específica.

Otra desventaja de los inmunoensayos se debe a su dependencia en la expresión de un gen recientemente introducido. Después de todo, la modificación genética no siempre resulta en la producción de una nueva proteína. Este es, por ejemplo, el caso del tomate genéticamente modificado FlavrSavrTM, en donde el RNA es producido para suprimir la producción de la proteína poligalacturonasa a fin de retrasar el proceso de maduración.

En otros casos, el nivel de expresión del DNA introducido puede ser muy bajo para ser detectado. Más aún, los niveles de expresión de proteína pueden variar de un tejido a otro. La expresión puede ser más alta en ciertas partes de la planta o en ciertas fases del desarrollo fisiológico. Como resultado, la proteína transgénica podría no estar presente en la parte de la planta que se utilizada en la producción de alimento. Por ejemplo, la endotoxina cry1A del maíz GM Bt176 es expresada en los tejidos verdes y en el polen de la planta; dado que la nueva proteína no es expresada en los granos de maíz, los análisis de proteína en los granos no revelarán la presencia de la proteína ajena.

La expresión es adicionalmente influenciada por factores externos, como el clima, el suelo y otras condiciones de cultivo. Esto complica la cuantificación del GMO por métodos de detección basados en proteínas. La cuantificación de GMOs por el uso de inmunoensayos es aún más compleja, dado que los ensayos generan valores absolutos, tales como la cantidad total de una nueva proteína presente. Para cumplir con la legislación de etiquetado de GMO, sin embargo, no es la cantidad absoluta sino la cantidad relativa del rasgo GM la que es importante, esto es la cantidad relativa del rasgo GM contra la contraparte convencional del mismo ingrediente (por ejemplo, el porcentaje de soya GM en la soya total en el producto alimenticio). La cuantificación relativa basada en proteína es solamente posible si una proteína específica a una especie o a un taxón es medida simultáneamente o si existe una muestra de un ingrediente único y está disponible un material de referencia apropiado para la curva de respuesta a dosis estándar.

Dado que no hay estructuras comunes a todas las proteínas GM o grupos de proteínas GM y un solo anticuerpo se unirá solamente a una proteína particular, los inmunoensayos son menos apropiados para un análisis general de GM. Más aún, los métodos basados en proteínas no pueden distinguir entre diferentes variedades GM que expresan la misma proteína.

 

El papel de los métodos de detección basados en proteína en la rastreabilidad de GMO

A pesar de sus limitaciones, los inmunoensayos juegan un importante papel en la rastreabilidad de organismos genéticamente modificados en la cadena de producción alimentaria. El objetivo de los sistemas de rastreabilidad es garantizar la diferenciación entre alimentos con diferentes atributos. Los sistemas de rastreabilidad representan instrumentos para proveer dicha diferenciación en una forma confiable y documentada. La rastreabilidad de cultivos transgénicos está fundamentada en una combinación de chequeos basados en papel a lo largo de la cadena de producción y pruebas analíticas en los puntos críticos del esquema de producción alimentaria.

El proceso ideal incluye a todos los participantes. Mientras que la compañía de semillas típicamente realiza análisis de la calidad de semilla en sus instalaciones por PCR, el agricultor utilizará la prueba de flujo lateral. Luego de la cosecha, los productos son transportados de la granja al elevador de grano, donde instrumentos de flujo lateral son también utilizados. A partir de ahí, el producto es transportado a los procesadores (productores de ingredientes) donde típicamente prueban los productos que arriban por ELISA o por PCR en tiempo real, utilizando un laboratorio contratado. Los productos son enviados luego al procesador de alimento, que normalmente cuenta también con un laboratorio contratado para realizar pruebas de PCR en tiempo real. Por último, el minorista que exhibe los productos terminados en los estantes, también prueba los productos para asegurarse de que cumplen con los requerimientos de la reglamentación.

En cada etapa los productos estarán acompañados de la documentación apropiada para certificar su origen. Hay una probabilidad significativa de tener contaminación cruzada debido a que algunos elevadores, barcos, camiones, barcazas y líneas de producción son utilizados para material transgénico y no transgénico. La opción favorecida es la cadena de producción en donde el transporte y las líneas de producción para materiales transgénicos y no transgénicos están separados y en donde está disponible un sistema completo de chequeo y pruebas analíticas.

A medida que más GMOs sean desarrollados y entren la cadena de alimentos y piensos, el desarrollo de métodos de alto rendimiento será más importante. También deberá darse atención al desarrollo de pruebas capaces de detectar varios GMOs simultáneamente, minimizando los costos y tiempo de análisis.

En el futuro, es posible que sean desarrolladas pruebas que detecten múltiples proteínas utilizando una sola tira de flujo lateral, pues en la actualidad ya existen tiras capaces de detectar hasta 3 diferentes GMOs.

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