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Características de los alérgenos más importantes en la leche de vaca

Alérgenos en la leche de vacaLa leche animal producida por las vacas (Bos taurus) contiene muchas proteínas alergénicas, razón por lo cual la leche y los productos lácteos (incluida la lactosa, un carbohidrato) están listados en el Anexo IIIa de la Directiva de la Unión Europea en el etiquetado de alimentos para consumo humano. La alergia a la leche de vaca es la alergia más común a alimentos durante la niñez, especialmente hacia el tercer año de vida, pero la mayoría de los casos se vuelven tolerantes a la leche pocos años después. Algunas veces, pero menos frecuentemente, aparece alergia a la leche de vaca en adultos.

Los síntomas causados por las proteínas alergénicas en la leche vacuna son variados y afectan casi todos los sistemas corporales humanos. Los más fácilmente observables, asociados con la alergia a la leche de vaca (CMA, por sus siglas en inglés) son síntomas gastrointestinales como dolores abdominales, heces sueltas, diarrea, vómito, constipación crónica, cólico, gastroenteritis eosinofílica, nausea y edema de la lengua. Los síntomas cutáneos, incluyendo dermatitis atópica, angioedema, urticaria, enrojecimiento y prurito son molestos e incómodos para quien los padece y para quienes lo rodean. Hay también síntomas del sistema respiratorio, por ejemplo, bloqueo nasal alérgico, tos, broncoespasmo, estornudo y asma, entre otros. Las más peligrosas son las reacciones sistémicas, como la anafilaxis y la anafilaxis inducida por ejercicio, que pueden llegar a ser mortales.

La leche de vaca contiene entre 30 y 35 g de proteínas por litro, de las cuales las caseínas constituyen el 80 % y las proteínas de suero el 20 %.

 

Caseína

La caseína bovina está listada por la Unión Internacional de Sociedades Inmunológicas como un solo alérgeno, Bos d 8. Sin embargo, contiene 4 principales proteínas componentes, α-s1-caseína, α-s2-caseína, β-caseína y κ-caseína, en proporciones aproximadas de 40%: 10%: 40%: 10%, respectivamente. Las fracciones obtenidas luego de coagulación ácida de las caseínas individuales están reticulares en agregados llamados nanoagregados, los cuales se combinan en micelas. Su parte central es hidrofóbica, con partes periféricas hidrofílicas que contienen sitios de fosforilación.

Las caseínas no mantienen una única conformación doblada, lo que ha derivado a que se les denomine como reomórficas, y son altamente sensibles a la proteólisis. Sin embargo, como la estructura doblada está limitada, el calentamiento, por lo general, no cambia la estructura y por tanto su capacidad de unión a inmunoglobulina E (IgE).

α-s1-caseína, α-s2-caseína y  β-caseína son capaces de quelar Ca2+ , Zn2+ y Fe3+ . Se ha comprobado que la desfosforilación reduce la unión de IgE a las caseínas. Las caseínas son la principal fuente de fosfato y calcio para el ternero.

 

α-s1-caseína tiene un peso molecular en el rango 27-32 kDa, dependiendo de las condiciones de análisis. Consiste de polipéptidos mayores y menores que están construidos de la misma secuencia de aminoácidos, pero difieren en el grado de fosforilación. Las caseínas forman complejos micelares estables de proteína fosfato de calcio; sin embargo, también se reportan grandes agregados. Se han identificado epítopes alergénicos en las regiones 19-30, 93-98 y 141-150 como epítopes inmunodominantes.

Algunas regiones secuenciales de unión a IgE se han reconocido en aminoácidos 17-36, 39-48, 69-78, 93-102, 109-120, 123-132, 139-154, 159-174 y 173-194, utilizando suero de niños de 9 años de edad o mayores, al tiempo que los epítopes en los aminoácidos 69-78 y 175.192 han sido reconocidos por 60 % y 80 % de suero de niños más grandes. Adicionalmente, los sitios de unión parecen ser predictivos en el caso de niños que al crecer no se libran de su alergia.

Un estudio posterior ha mostrado que los péptidos en las terminales N- y C-, aminoácidos 16-35 y 136-155, tienen la mayor afinidad de unión a IgE humana, mientras que los aminoácidos 1-18 y 181-199 muestran alta afinidad a IgG de conejo.

Modelo tridimensional α-s1-caseína

 

α-s2-caseína tiene un peso molecular en el rango 27-32 kDa y es la más hidrofílica de todas las caseínas, porque tiene un agregado de grupos aniónicos. α-s2-caseína consiste de 2 componentes mayores y varios componentes menores que exhiben varios niveles de fosforilación post-traducción. α-s2-caseína es fosforilada en sitios múltiples. La estructura de α-s2-caseína consiste de aproximadamente 25 % de α-hélice, contiene 3 cisteínas y forma dímeros por unión disulfuro.

Utilizando 99 decapéptidos sintéticos, se han identificado como alergénicas 10 regiones de unión a IgE de suero humano en los aminoácidos 31-44, 43-56, 83-100, 93-108, 105-114, 117-128, 143-158, 157-172, 165-188 y 191-200. La investigación en la presencia de algunos epítopes de α-s2-caseína ha llevado a la identificación de alergias persistentes y transitorias. Los residuos 33-42, 87-96 y 159-168 con unión débil a 145-154 y 171-180 se originan en individuos con alergia persistente a la leche de vaca. Los pacientes con alergias transitorias muestran solamente unión débil a péptidos de α-s2-caseína.

Se ha sugerido que algunas de las regiones fosforiladas, residuos 23-31, 73-76 y 144-146, forman parte de los epítopes IgE y que los fosfatos están involucrados en el reconocimiento del anticuerpo.

 

β-caseína tiene un peso molecular de 26.6 kDa y es el componente más hidrofóbico de la caseína total. Se conocen variantes de secuencia gracias a proteólisis parcial y a variantes de genes. β-caseína está menos fuertemente fosforilada que las α-caseínas con 5 sitios fosfoserina potenciales en la parte terminal N de la secuencia. La proteasa parte a la β-caseína en fragmentos γ-1, γ-2 y γ-3. β-caseína también se une a calcio formando nanoagregados.

Un ciento de decapéptidos sintéticos se utilizaron para estimar la región β-caseína que une IgE en pacientes, y los residuos de aminoácidos 1-16, 45-54, 55-70, 83-92, 107-120, 135-144, 149-164, 167-184 y 185-208 se describen como característicos para pacientes con alergias persistentes a la leche de vaca. El suero de pacientes más jóvenes da un patrón más simple con unión IgE en los residuos  1-16, 45-54, 83-92, 107-120 y 135-144 con unión débil a los residuos 57-66 y la región C-terminal.

También se ha observado que la respuesta IgE a la β-caseína desfosforilada es menor que a la β-caseína nativa, por lo que la región N-terminal fosforilada, residuos 30-50, probablemente incluye importantes epítopes IgE.

Modelo tridimensional β-caseína

 

κ-caseína tiene un peso molecular de 21,269 Da como precursor y 19,023 Da como forma madura, consistiendo de un componente mayor libre de carbonato y un mínimo de 6 componentes menores. HA sido aislado de la leche como una mezcla de polímeros con uniones disulfuro que van de los dímeros a los octámeros.

κ-caseína juega un importante papel en la estabilidad y propiedades de coagulación de la leche. Es probablemente más estructurada que α- y β-caseínas y contiene disulfuros específicos, que pueden rearreglarse con el calentamiento. κ-caseína es muy sensible a la proteólisis. Su hidrólisis por quimosina en cuajo produce para- κ-caseína y un caseinomacropéptido que participa activamente en el proceso de fabricación de quesos. El potencial alergénico sobrevive a la cocción y la κ-caseína es crítica para la estabilidad de las micelas de caseína.

Modelo tridimensional κ-caseína

Diagnosticar a los pacientes con alergias persistentes a la leche bovina, gracias al uso de 80 decapéptidos sintéticos traslapados, ayudó a identificar algunas regiones de unión a IgE en el suero humano, con los residuos 15-24, 37-46, 55-80, 83-92 y 105-116.

 

Proteínas del suero

Las proteínas del suero contiene varios importantes alérgenos, tales como β-lactoglobulina (β-lg) y α-lactoalbúmina (α-la), y constituyentes menores, como lactoferrina, albúmina de suero bovino e inmunoglobulinas. En esta fracción, los fragmentos proteolíticos de caseína y proteínas de membrana de los glóbulos de grasa pueden aparecen durante el análisis.

 

α-lactoalbúmina, Bos d 4, es un homólogo de las lisozimas tipo C. Tiene un peso molecular de 14,186 Da en la forma de proteína madura, y de 15,840 a 16,690 Da con la estructura glucosilada. α-la es estabilizada por unión con calcio. Se ha reportado que es dividida por pepsina a pH 2 en la región de los residuos 34-57, produciendo fragmentos grandes.

Se han investigado los efectos del calentamiento en α-la purificada, mostrando que el grado de agregación irreversible varía a temperaturas entre 67°C y 95°C. Cuando le leche es calentada a 95°C, α-la se desnaturaliza más lentamente que β-lg. La estructura doblada de α-la es desestabilizada a pH bajo con la formación de un glóbulo fundido. La estabilidad de la desnaturalización es fuertemente disminuida por la reducción de disulfuros; el intercambio de disulfuros puede ocurrir durante la desnaturalización térmica, llevando a la formación de agregados.

Aunque evolucionada de una lisozima, la función de α-la es la formación de un complejo con galactosil-transferasa, alterando su especificidad de sustrato para incrementar la tasa de formación de lactosa en la síntesis de la leche. El complejo de galactosil-transferasa y α-la se llama lactosa-sintetasa. α-la por sí misma no tiene actividad catalítica como una lisozima o como una sintetasa.

Se han descrito otras propiedades de α-la y algunas funciones adicionales posibles, incluyendo la unión de varios ligandos y actividad antimicrobiana, tanto como una molécula completa y como péptidos. Los efectos citotóxicos contra células mamíferas también han sido investigados.

El componente principal de α-la no está glucosilado. Sin embargo, hay una forma glucosilada menor (aproximadamente 10 %) con un espectro de masa que contiene al menos 15 picos discretos. Estos rugen de la glucosilación de asparagina 45.

Un estudio concerniente a las propiedades alergénicas de α-la ha mostrado que en 60 % de los pacientes, el suero alérgico es específico para la α-la intacta con solamente el 40 % uniéndose a los péptidos obtenidos por hidrólisis tríptica. El residuo 17-58 es el más frecuentemente reconocido, seguido por los aminoácidos 59-93, 99-108 y 109-123. Los epítopes lineales fueron identificados utilizando suero de pacientes que sufren de alergias persistentes y sus IgE a la leche de vaca son mayores a 100 kU(A)/l. IgE del suero se unió más fuertemente a los residuos 1-16, 13-26, 47-58 y 93-102.

 

β-lactoglobulina tiene un peso molecular de 18 kDa y pertenece a la superfamilia lipocalina. β-lg se identifica como Bos d 5 como alérgeno, es capaz de unirse a lípidos, incluyendo retinol, β-caroteno, ácidos grasos saturados e insaturados, hidrocarburos alifáticos y moléculas hidrofóbicas transportadoras, lo que es una función importante.

Esta es la fracción más abundante, constituyendo hasta el 50 % de la proteína total del suero. Bajo condiciones fisiológicas, β-lg existe como una mezcla en equilibrio de formas monoméricas y diméricas. La proporción de monómeros se incrementa por calentamiento a 70°C. Se forman oligómeros por debajo de pH 6, con el más grande, un octámero, formado alrededor de pH 4.6 y disociándose por debajo de pH 3. Arriba de pH 8 la proteína se desnaturaliza irreversiblemente, lo que puede llevar a agregación.

β-lg posee 3 puentes disulfuro y está presente en algunas variantes A, B y C encontradas en la raza Jersey. β-lg es sensible a los procesos térmicos. Calentando β-lg a 74°C se reduce la unión a IgE significativamente, y calentando a 90°C la reducción es más extensa.

La proteólisis y el uso de anticuerpos monoclonales han probado que β-lg posee muchos epítopes alergénicos repartidos sobre la estructura β-lg. Los epítopes IgE humanos mayores para fragmentos de aminoácidos β-lg están compuestos de los residuos 41-60, 102-124 y 149-162; los epítopes intermedios en 1-8, 25-40 y 92-100; y los epítopes menores en 9-14, 84-91, 125-135 y 78-83. Regiones epítope IgE similares se han reportado en rata (como modelo animal de alergia a β-lg).

Modelo tridimensional lactoalbúmina

 

Lactoferrina tiene un peso molecular de aproximadamente 67 kDa. Muestra 2 transiciones por calorimetría de escaneo diferencial, con el primer pico a 65°C y el segundo a 92°C; estos corresponden a la desnaturalización de lactoferrina cargada con apo y cargada con hierro, respectivamente.

La lactoferrina es una glicol-proteína. Si la entidad carbohidrato es separada, entonces la actividad de unión a hierro es reducida. Lactoferrina tiene varios papeles antimicrobianos y su expresión es incrementada en respuesta a infección. Su actividad principal es el secuestro de hierro. También puede proteger a las células del daño por radicales libres, removiendo el hierro libre catalítico. El péptido antimicrobiano lactoferricina comprende los residuos 17-41 de la lactoferrina madura o los residuos 36-60 del precursor. El péptido 265-284 también posee actividad antimicrobiana.

En un estudio en pacientes de 4 a 14 meses de edad, alérgicos a la leche de vaca, el 50 % de las muestras de suero contuvo IgE contra lactoferrina.

 

La albúmina de suero bovino (BSA) se conoce como Bos d 6 como alérgeno. Constituye el 5 % de las proteínas totales del suero y es tanto física como inmunológicamente muy similar a la albúmina de suero sanguíneo. La albumina de suero regula la presión osmótica coloidal de la sangre; se une a varios cationes y es el principal transportador de ácidos grasos, hormonas y bilirrubina, que de otra manera sería insoluble en plasma. Además de ser la proteína más abundante en el plasma, su bajo nivel encuentra el camino hacia la leche. Esta proteína se ha observado como monómero y como dímero, con pesos moleculares 66,474 Da y 133,029 Da, respectivamente, estimados por espectrometría de masa por ionización de electroaerosol. Dichas masas tan altas se deben a los iones unidos a las moléculas de agua.

Tres dominios homólogos, consistentes de 9 rizos, son protegidos en el centro y estabilizados por 17 puentes disulfuro, haciendo la estructura terciaria de BSA relativamente estable aún durante la desnaturalización. Calentando a 75°C y más, produce oligómeros unidos por disulfuros.

Se han revisado los datos de unión a IgE, utilizando suero de pacientes alérgicos a la res, notando que la reducción de los disulfuros reduce, pero no abole, la unión con IgE. Se ha reportado que epítopes secuenciales son capaces de resistir la proteólisis por 60 min cuando BSA es digerida in vitro con pepsina a la relación enzima:sustrato de 1:120 (peso/peso) y la región 524-542 es la que se une más fuertemente a la IgE humana. La anafilaxis debida a albúmina de suero bovino también ha sido reportada en un paciente inyectado con células cultivadas en suero de ternero fetal.

La estructura tridimensional de BSA no ha sido determinada completamente. Los residuos 126-144 han sido reportados como responsables de la reacción autoinmune dirigida hacia las células de isletas pancreáticas que causan la diabetes; esto permanece en controversia, pero remover este epítope así como el punto de unión IgE es con frecuencia un objetivo en la producción de fórmulas infantiles.

 

La inmunoglobulina Bos d 7, IgG existe como un tetrámero unido por disulfuro de unos 160 kDa, de dos cadenas gruesas y dos delgadas. Las inmunoglobulinas son una parte importante del sistema inmune humoral y funcionan uniéndose específicamente a agentes ambientales como virus, bacterias, alimentos y toxinas. Se ha reportado que del 59 % al 76 % de la IgG bovina nativa puede ser detectada después de la pasteurización comercial, durante un tratamiento térmico suave de la leche como el calentamiento a 72°C por al menos 16 segundos, seguido de un enfriamiento rápido. Algunas IgG bovinas contienen cadenas de azúcares N-unidas N-acetilgalactosaminiladas.

 

Gracias a la investigación sobre los diversos alérgenos en la leche de vaca, se han desarrollado procesos tecnológicos (térmicos, químicos, enzimáticos, irradiación o enmascarado de epítopes, entre otros) que buscan inhibir dichos alérgenos mediante la modificación molecular.

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2 comentarios

  1. Chris

    El ser humano es el único animal que bebe leche tras su período de lactancia natural, y encima de otros animales.

    31/12/2012 en 17:46

    • StaffNP

      Tienes un buen punto Chris, la expansión de la especie (en particular hacia regiones con escasos recursos) y la domesticación de animales y plantas ha derivado en conductas dietarias diversas que nos obligan a “adaptarnos” a nuevos alimentos, a pesar de que, como se señale en este artículo, contienen compuestos bioactivos que pueden resultar agresivos para una parte significativa de la población.

      Coincido contigo en que no es necesario que los humanos beban leche más allá de la infancia, pues hay excelentes fuentes de proteínas, lípidos y carbohidratos, tanto de origen animal como vegetal, que podrían cubrir las necesidades nutricias.

      Saludos.

      31/12/2012 en 18:30