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Temas preanalíticos en los estudios proteómicos clínicos

Factores preanalíticos, que se deben considerar antes análisis de la muestra Las iniciativas proteómicas tienen un gran potencial para contribuir en la medicina en términos de descubrimiento de biomarcadores u objetivos terapéuticos. Sin embargo, concurrente con la explosión en el número de publicaciones que reportan el descubrimiento de biomarcadores por tecnologías de perfilado como la espectrometría de masas (MS, por sus siglas en inglés) y la electroforesis bidimensional en gel de poliacrilamida (2D-PAGE, por sus siglas en inglés), ha habido un incremento en la evidencia que resalta los problemas con la robustez de algunos estudios. Dichos problemas han surgido por varias razones, pero la tendencia o parcialidad, que ha sido descrita como “la mayor amenaza a la validez” en la investigación de biomarcadores, permanece como uno de los principales factores.

Factores preanalíticos

Los factores preanalíticos, que ocurren antes del punto del análisis mismo de la muestra, pueden ser subdivididos en base a su naturaleza biológica o técnica; los últimos surgen de los efectos de la recolección, procesamiento y almacenamiento de la muestra (el prefraccionamiento o preparación de la muestra inmediatamente antes del análisis es dependiente del acercamiento y puede ser considerado como analítico). El impacto de las variables preanalíticas en la calidad de muchas mediciones de química y hematología clínicas de rutina que utilizan fluidos corporales es bien reconocido. Con el uso de muchas tecnologías proteómicas que permiten el análisis simultáneo de cientos o miles de proteínas a la vez, con límites de detección más sensibles y rangos de masa globales más amplios, el impacto de los factores preanalíticos puede ser mayor. Sin embargo, son relativamente pocos los estudios proteómicos que han considerado o específicamente señalado dichos temas.

 

Variación biológica

La premisa básica detrás de los estudios proteómicos clínicos es que el proceso de la enfermedad en estudio producirá cambios en el proteoma, a nivel de tejido o de fluido biológico. Sin embargo, al considerar un grupo de pacientes, un número de efectos biológicos no relacionados a la enfermedad serán también superimpuestos e influenciarán a cada proteoma. Estos pueden ser referidos como 1) influencias intrínsecas que son características individuales de un sujeto, tales como género, edad, etnicidad y estado endócrino, y 2) influencias extrínsecas que incluyen la dieta (tipo y estado), fumar o consumo de alcohol, ejercicio, medicamentos, etc.

Aunque muchos factores intrínsecos tales como el género están “fijos” para un sujeto particular, algunos son más variables pero pueden ser estandarizados, como los ritmos circadianos. La investigación de los efectos de dichas variables biológicas “normales” en los proteomas de fluidos (y tejidos) biológicos es difícil sin estudios epidemiológicos a gran escala para evitar los potenciales factores confundidores. Prácticamente, sin embargo, esto significa que los estudios son relativamente pequeños y las conclusiones, por lo tanto, están sujetas a esta advertencia. La mejor forma de controlar dichos efectos potenciales es por estandarización de los grupos y minimizar las tendencias o imparcialidades potenciales, al nivel de diseño del estudio.

 

Factores e influencias intrínsecos

Hay muchos ejemplos de proteínas específicas que son afectadas por dichas influencias, pero pocos efectos han sido examinados sistemáticamente a nivel global. Un análisis a fondo de los péptidos séricos <15 kDa por espectrometría de masas mediante desorción/ionización laser asistida por matriz con tiempo de vuelo (MALDI-TOF, por sus siglas en inglés) de 200 individuos sanos, sugiere que los efectos de la edad y el género en los perfiles es generalmente insignificante; aunque en el grupo de edad <35 años, los hombres y mujeres podrían ser distinguidos con un 70% de precisión, indicando algunas sutiles diferencias.

Un análisis comparativo de proteínas de mayor peso molecular en humanos utilizando 2D-PAGE, por ejemplo, no ha sido reportado, aunque dicho estudio en ratas ha mostrado marcadas diferencias de género en la concentración de hasta el 35% de las proteínas.

También se ha demostrado que los perfiles urinarios generados por espectrometría de masas mediante desorción/ionización laser mejorada para superficie (SELDI, por sus siglas en inglés) incluyen varios picos potencialmente influenciados por edad o género, y los estudios iniciales indican que el género también puede influenciar los perfiles 2D-PAGE.

Utilizando etiqueta por afinidad codificada por isótopo (ICAT, por sus siglas en inglés) en combinación con un acercamiento proteómico shotgun, se encontró que  aproximadamente el 10% o más de las 300 proteínas identificadas en el fluido cerebroespinal (CSF, por sus siglas en inglés) difieren por más del 20% en su concentración entre los grupos de edad más viejos y más jóvenes. Aunque esto está basado en muestras reunidas, la validación independiente en muestras individuales confirmó varios resultados.

Varis proteínas plasmáticas, como haptoglobina, α1-antitripsina, α2-HS-glucoproteína, transtirretina y miembros de la familia de las apolipoproteínas, son conocidas por polimórficas, migrando con frecuencia de manera diferente en 2D-PAGE debido a los cambios en el punto isoeléctrico, y produciendo también picos en los perfiles MALDI.

En algunos casos, hay distintas asociaciones de enfermedad con variantes particulares, pero el antecedente étnico puede ser igualmente importante con diferentes formas predominantes, dependientes de la población.

 

Factores e influencias extrínsecos

Utilizando un estudio controlado de intervención dietaria, el perfilado SELDI del suero encontró 2 picos significativos, uno de los cuales fue identificado como la cadena B de α2-HS-glucoproteína, el cual podría distinguir entre una dieta basal vs una crucífera con 76% de precisión. En adición a la naturaleza de la dieta, el tiempo de la recolección de la muestra en relación a la alimentación puede ser importante, aunque relativamente menor, con solamente 15 picos <15 kDa cambiando significativamente en los perfiles MALDI de plasma luego de un reto oral de glucosa, 2 de los cuales fueron identificados como insulina y C-péptido.

De forma similar, de un total de 101 picos <24 kDa examinados en suero, solamente 5 cambiaron entre el ayuno y el post-desayuno. Similarmente hay indicaciones de que la carga de agua, pero no el consumo de café, puede afectar no solamente la concentración total de proteína (como es de esperarse) sino también proteínas específicas.

Los factores de estilo de vida, como el consumo de alcohol, han sido reportados como alteradores de los perfiles proteómicos con cambios en la microheterogeneidad de varias proteínas en plasma, incluyendo transferrina, haptoglobina y α1-antitripsina en 2D-PAGE en muestras de pacientes alcohólicos sin enfermedad hepática, y el consumo de alcohol ha sido asociado con cambios en el fibrinógeno.

El ejercicio resulta en varios cambios en el proteoma urinario con un incremento en la proporción de proteínas tales como albúmina, transferrina e inmunoglobulina G (IgG), así como en un número de proteínas de bajo peso molecular.

 

Variables técnicas

La mayoría de los estudios en proteómica clínica se ha enfocado en muestras de sangre y orina, aunque los puntos ilustrados en las rutas de recolección y procesamiento de muestras también pueden aplicarse, al menos parcialmente, a otros fluidos y tejidos.

 

Modo de recolección de espécimen o muestra

Aunque para las muestras de sangre, los efectos gruesos de factores tales como postura del paciente y aplicación del torniquete han sido descritos con concentraciones de muchas proteínas tales como albúmina e inmunoglobulinas, incrementándose un promedio de 10% cuando los especímenes son recolectados de pacientes en la posición sentada, en comparación con aquellos en la posición supina, no hay estudios proteómicos que hayan explorado dichos efectos. Es posible que dichos factores ejercieran un efecto potencial en los estudios proteómicos, pero estos son muy difíciles de estandarizar en los estudios de investigación en centros muy ocupados.

En ciertas circunstancias, las muestras de sangre pueden ser más susceptibles a hemolisis, por ejemplo, si se obtienen vía canulación, son expelidas de la jeringa a través de la aguja, son sujetas a manipulación muy vigorosa o en ciertas enfermedades. Dicha hemolisis puede no ser fácilmente aparente al ojo, pero puede apreciarse en los geles de poliacrilamida o alternativamente como picos característicos para las cadenas de α y β hemoglobina (y adicionalmente algunos picos <7,000 Da) en los espectros de MALDI o SELDI; en estos últimos casos, podrían potencialmente influenciar los resultados vía efectos en la ionización o al competir por la superficie del chip.

Los análisis de CSF también han mostrado que las proteínas en las muestras contaminadas con sangre son menos estables que aquellas en las muestras sin contaminación, casi seguramente por la presencia de proteasas de origen sanguíneo. Para las muestras de orina, se ha demostrado que el método preciso de muestreo es importante con las variaciones en los perfiles SELDI-TOF entre las orinas “evitar la primera del día” y “de chorro medio” en mujeres, potencialmente atribuible a contaminación bacteriana.

 

Tipo de contenedor de la muestra

El suero y el plasma exhiben diferencias como resultado de la coagulación, lo que no es sorprendente, específicamente la remoción de fibrinógeno, pero otra diferencias son aparentes por 2D-PAGE. El examen de proteínas o péptidos de bajo peso molecular utilizando SELDI o MALDI muestra aún más diferencias, extremadamente notables, no solamente entre suero y plasma, sino también entre muestras de plasma, dependiente del tipo de anticoagulante. Ahora se sabe que muchas de estas diferencias se deben a fragmentos de péptidos o proteínas derivados directa o indirectamente de las cascadas de coagulación y complemento.

El uso de tubos conteniendo un separador a base de gel puede también  introducir diferencias, comparado con los tubos equivalentes sin gel, aunque no está claro si esto surge debido a efectos en los cambios relacionados a la coagulación o a los péptidos/proteínas per se. No hay estudios que hayan examinado sistemáticamente dichos temas, utilizando acercamientos como 2D-PAGE, por ejemplo, en donde las proteínas más grandes pueden ser mejor analizadas.

Se ha demostrado que existen variaciones sistemáticas entre suero y diferentes tipos de plasma para análisis de inmunoensayo y microarray de 237 analitos únicos, probablemente causados por una mezcla de factores, incluyendo efectos de dilución debido al anticoagulante de citrato, efectos diferenciales de los anticoagulantes, y procesos de manejo de la muestra en la estabilidad celular, etc., pero resulta claro que no hay un procedimiento que sea ideal para todos.

El material del tubo mismo puede también ser importante. En el CSF, las mediciones de proteínas β-amiloide y Tau difieren cuando son recolectadas en tubos de diferentes materiales, siendo más bajas en tubos de poliestireno, presumiblemente debido a diferentes niveles de interacción y adsorción con las diferentes superficies. Múltiples picos de interferencia en la región 100-300 m/z de los espectros MALDI-TOF, consistentes con compuestos poliméricos tales como polivinilpirrolidona, se han encontrado con algunos tipos de tubo para sangre, y similarmente, los polímeros derivados de diferentes marcas de tubos plásticos y coagulantes específicos pueden causar efectos de supresión iónica.

La consideración del uso eventual de la muestra puede también gobernar parcialmente la selección de los aditivos del tubo, como los anticoagulantes. Por ejemplo, la quelación de cationes divalentes por el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA, por sus siglas en inglés) obviaría su uso en ensayos que son dependientes de dichos iones, mientras que las moléculas altamente cargadas de heparina se unen a proteínas y pueden también interferir en las separaciones cromatográficas.

El uso de cocteles inhibidores de proteasa como aditivos puede ser benéfico en la prevención de proteólisis in vitro, por ejemplo en orina, aunque los fluidos como suero y plasma contienen una buena cantidad de inhibidores endógenos de proteasa. Sin embargo, los inhibidores de proteasa per se pueden también resultar en cambios adicionales; por ejemplo, isoformas adicionales de pI más alto de varias proteínas en suero y plasma son aparentes en 2D-PAGE, lo cual es al menos en parte atribuible a modificación por el inhibidor de proteinasa fluoruro de 4-(2-aminoetil)bencensulfonilo (AEBSF, por sus siglas en inglés). Una consideración importante aquí es también el concepto emergente de que la actividad exoproteasa específica de la enfermedad superimpuesta en las cascadas de complemento y coagulación ocurriendo ex vivo puede resultar en fragmentación, específica de la enfermedad, de las proteínas séricas, lo que puede ser interrumpido dependiendo de los inhibidores utilizados.

 

Condiciones de procesamiento y manejo de la muestra

Se han descrito marcadas diferencias, particularmente en péptidos y proteínas de bajo peso molecular, en muestras de suero y plasma, como resultado de diferencias en la longitud de tiempo post-punción, antes de que las muestras sean procesadas y la fase fluida removida de los componentes celulares. Esto parece deberse no solamente a diferentes etapas de los procesos de coagulación y complemento, sino también a la liberación de productos derivados de las células luego de la síntesis aumentada de proteínas durante la manipulación de la muestra o cuando la estabilidad de la célula disminuye.

El potencial para la regulación a la alza de proteínas puede ser visto examinando un gran número de transcriptos que cambian en las células mononucleares de sangre periférica (PBMC, por sus siglas en inglés) en el tiempo ex vivo. El citrato podría minimizar la activación de las plaquetas, pero su uso en forma líquida introduce una etapa de dilución que tiene el potencial para variar con el hematocrito debido en parte a su llenado insuficiente de los tubos (el EDTA podría ser una alternativa).

Para plasma, por lo tanto, las muestras deben ser procesadas rápidamente, pero para suero se debe proporcionar suficiente tiempo para la coagulación adecuada, considerando los diferentes efectos de edad, género y factores exógenos tales como el uso de anticonceptivos orales o el fenotipo de coagulación, aunque no debe permitirse que los efectos secundarios sean más marcados.

La velocidad y el tiempo de centrifugación han sido examinados en un pequeño estudio, encontrándose que tienen un impacto relativamente pequeño en los perfiles séricos. Críticamente para el plasma, la velocidad debe ser suficiente para sedimentar las plaquetas. Una segunda etapa de centrifugación o filtración suave pueden ser estrategias adicionales. Por razones similares, se recomienda evitar las bajas temperaturas de procesamiento que llevan a la activación de las plaquetas.

El análisis de los componentes principales de los estudios iniciales SELDI/MALDI indica que la temperatura a la cual las muestras sin separar son sometidas antes de su procesamiento, también altera los perfiles de suero y plasma. El efecto parece ser complejo y puede deberse solo en parte a la activación directa de las plaquetas.

 

Almacenamiento de la muestra

La mayoría de los estudios proteómicos clínicos son realizados utilizando muestras de banco con tiempos de almacenamiento que varían de unas pocas semanas a varios años, principalmente a temperaturas de -70/-80°C, pero también se utilizan temperaturas de -20°C. La importancia de dichos factores es difícil de evaluar y es muy específico a proteínas, pero podría potencialmente ejercer efectos marcados en los resultados del estudio.

Un estudio temprano utilizando 2d-PAGE mostró varios pequeños pero reproducibles cambios en las muestras de plasma almacenadas por varios meses a -20°C. El perfilado basado en MALDI mostró un pequeño efecto en los perfiles séricos de la temperatura post-separación hasta por lo menos 2-4 horas, independientemente de si fueron almacenadas a temperatura ambiente o a 4°C (las muestras expuestas a temperaturas de 40°C exhibieron cambios dentro de los primeros 30 minutos), pero los cambios que ocurrieron subsecuentemente son menos marcados a 4°C.

Tendencias similares ocurrieron en el almacenamiento a largo plazo de suero en un amplio rango de temperaturas; más cambios vistos a temperatura ambiente y a 4°C que a temperaturas de -20°C, -80°C o en nitrógeno líquido, se han reportado dentro del proyecto de proteoma plasmático de la Organización del Proteoma Humano (HUPO, por sus siglas en inglés), utilizando tanto SELDI, 1D-PAGE y 2D-PAGE como métodos de análisis.

La refrigeración hasta por 24 horas antes de la congelación también a mostrado un efecto deteriorante en los perfiles de orina, aunque la estabilidad puede ser influenciada por el proceso de recolección de la muestra, en donde las muestras de orina “de chorro medio” son mucho más estables cuando se almacenan a 4°C que las muestras de “evitar la primera del día”, reflejando potencialmente contaminación bacteriana y la subsecuente degradación aumentada de proteínas.

El congelado y descongelado ejerce efectos marcados en los perfiles de suero generados utilizando extracción de fase sólida basada en cuentas magnéticas, seguida de MALDI-TOF, con efectos en picos específicos y dependencia en el número de ciclos de congelación y descongelación, aunque 2 pequeños estudios con pocas muestras y pocos picos detectados reportó diferencias mínimas. El perfilado SELDI de orina ha mostrado una carencia de efectos significativos por hasta 4 ciclos de congelación y descongelación, pero con intensidades menores de pico con ciclos adicionales.

Existe mucha evidencia en la literatura de estudios que examinan proteínas particulares, claramente demostrando estabilidad específica para el analito y para el fluido durante el almacenamiento. Algunos ejemplos ilustran la importancia de considerar este aspecto en los estudios proteómicos y asegurar que los grupos son iguales en términos de condiciones de almacenamiento, utilizando preferiblemente almacenamiento a -80°C. Los niveles totales del marcador de tumor antígeno específico para próstata (PSA, por sus siglas en inglés) fueron estables en suero y plasma sujetos a almacenamiento a largo plazo a -20°C, pero los niveles de PSA libre en suero disminuyeron. La cistatina-C, un biomarcador potencial para enfermedades neurodegenerativas ha mostrado el rompimiento de la N-terminal durante el almacenamiento a -20°C, pero no a -80°C. En CSF, la proteína Tau ha mostrado ser estable por al menos 6 ciclos de congelación y descongelación, mientras que la proteína amiloide-β disminuyó en un 20% después de 3 ciclos, con diferencias similares en su estabilidad en almacenamiento.

En ejemplos adicionales, tanto en CSF como en plasma, se ha observado estabilidad variable en diferentes péptidos de amiloide-β, comprometiendo potencialmente su uso en el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer. Aunque las concentraciones de albúmina urinaria se reportan estables después de 6 meses en almacenamiento a -20°C, otros estudios reportan una disminución luego de 6 meses de almacenamiento a dicha temperatura y varias proteínas tales como la proteína ligadora de retinol y la N-acetilo-glucosaminidasa son subestimadas de forma variable luego del almacenamiento a -20°C. Algunos cambios pueden ser dependientes del pH, y el ajuste del pH ha sido recomendado para minimizar la precipitación durante el almacenamiento.

 

Es claro que aunque los estudios son pocos y con frecuencia relativamente pequeños, numerosos factores preanalíticos pueden influenciar marcadamente los estudios proteómicos clínicos. Es también claro que muchos de los efectos son muy específicos a algunas proteínas y que no existe un método ideal para todos.

El aspecto más importante es la consistencia y asegurarse de que las muestras utilizadas en los estudios sean manejadas de forma idéntica para los diferentes grupos, a fin de minimizar las tendencias y parcialidades, y que los factores confundidores potenciales conocidos sean incluidos en el análisis de los datos.

Las diferencias potenciales pueden ser luego validadas, y la astringencia de los protocolos de manejo de muestras deberá ser optimizada para el descubrimiento de marcadores individuales.

Existen algunos bancos de muestras muy valiosos, pero su valor es más limitado si los detalles del procesamiento no están disponibles. En este caso, los estudios pueden estar sujetos a muchas influencias desconocidas que resultan en un riesgo incrementado de conclusiones erróneas y desperdicio potencial de recursos, aunque la validación astringente subsecuente debería permitir la distinción entre los biomarcadores reales y los artefactuales.

Para cumplir el reto de evaluar y desarrollar criterios de consenso para la recolección y manejo de muestras, los acercamientos de consorcio están ya proceso constante, a fin de compartir recursos y construir un entendimiento común entre las comunidades investigadoras. La consideración cuidados de los procesos y variables preanalíticos es esencial si deseamos acelerar el crecimiento y la utilidad de la proteómica en las ciencias de la salud.

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