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Peptidómica para el análisis de péptidos bioactivos

Técnico revisando los resultados del análisis de Cromatografía Liquida de Alto Desempeño (HPLC)La peptidómica puede ser definida como el análisis completo de péptidos endógenos contenidos dentro de una muestra biológica bajo condiciones definidas, para describir la multitud de péptidos nativos en un compartimiento biológico. La peptidómica o “proteómica de péptidos” se refiere al análisis de todos los péptidos de una célula o tejido (peptidoma), mientras que la proteómica se refiere al análisis de las proteínas (proteoma).

La peptidómica involucra la visualización e identificación simultáneas del peptidoma a través del uso de técnicas de purificación y/o caracterización, y el conocimiento de la estructura y función de proteínas en el contexto biológico o bioquímico de todos los organismos. Los péptidos son secciones cortas de aminoácidos ligados por uniones peptídicas. La longitud de los péptidos varía de 2 aminoácidos (dipéptido) a varios (polipéptidos) hasta una masa molecular de 20 kDa. Los péptidos que son biológicamente activos juegan un papel importante en los procesos fisiológicos de un organismo, están estrechamente regulados por control proteolítico y sirven como biomarcadores ideales para el diagnóstico específico y sensible así como para la terapéutica.

Los péptidos bioactivos pueden ser clasificados como hormonas péptidas, neuropéptidos, citosinas y factores de crecimiento. La terminación de la fase inicial del Proyecto del Genoma Humano abrió nuevas oportunidades para la rápida identificación y análisis funcional de los péptidos. El campo de la peptidómica es relativamente nuevo  y progresa rápidamente con el advenimiento de tecnologías de alto rendimiento basadas en la espectrometría de masa (MS, por sus siglas en inglés), que incluye la desorción laser asistida por matriz-tiempo de vuelo-espectrometría de masa (MALDI-TOF-MS, por sus siglas en inglés), la cromatografía líquida de alto desempeño-espectrometría de masa (HPLC-MS, por sus siglas en inglés) y la electroforesis capilar-espectrometría de masa (CE-MS, por sus siglas en inglés). A pesar de la importancia de la electroforesis bidimensional en gel (2DGE, por sus siglas en inglés) para la proteómica, el método de elección para la peptidómica es la MS, dado que la 2DGE no favorece la separación de péptidos menores a 10 kDa en tamaño.

 

Métodos en peptidómica

La composición del peptidoma puede ser determinada por varios métodos, tales como la peptidómica por afinidad, la peptidómica combinatoria y MS con o sin reducción previa en la complejidad de la muestra.

 

Peptidómica por afinidad

En la peptidómica por afinidad, la composición del peptidoma es determinada utilizando anticuerpos inmovilizados, ensayando directamente el rango de péptidos obtenido de la digestión química o por proteasa de la mezcla proteínica de extractos biológicos. Se ha reportado que los agentes de afinidad desarrollados contra los péptidos más hidrofílicos resultan en un desempeño mejorado del ensayo de afinidad, posiblemente debido a que la mayoría de los péptidos son hidrofílicos.

La hidrofilidad y la inmunogenidad de los péptidos liberados, así como la disponibilidad de péptidos sintéticos como antígenos, han facilitado la generación de anticuerpos para la peptidómica por afinidad. La mayoría de las proteínas humanas, incluyendo las proteínas hidrofóbicas, rinden suficientes péptidos hidrofílicos en la digestión tríptica. Los chips son inmovilizados en un soporte sólido con arreglo (o array, como se le conoce) de anticuerpos capturados que reconocen específicamente una región de un fragmento péptido objetivo.

La identificación de las especies capturadas puede ser realizada por barrido fluorescente o por MS. En el barrido (o escaneo) fluorescente, los péptidos son etiquetados antes de la incubación para permitir una imagen espacialmente resuelta de fluorescencia en el barrido del chip. Aunque es posible un barrido más rápido y por lo tanto una obtención de información en menor tiempo con el barrido fluorescente, es incapaz de verificar que son capturados los péptidos correctos y no contribuye a la distinción entre modificaciones post-traduccionales (PTMs, por sus siglas en inglés) de los fragmentos de polipéptido. La MS permite la identificación de masa/carga (m/z) del péptido por desorción de las especies capturadas directamente del array, resultando en la identificación clara de las especies capturadas y en la identificación de PTMs. Sin embargo, algunas de las desventajas son que los cojines de hidrogel montados en silicio no son apropiados para MALDI-TOF-MS, los datos cuantitativos no pueden ser obtenidos directamente y varios factores influyen en la altura de los picos. Además del costo y disponibilidad de anticuerpos, la estabilidad de los péptidos y el no requerimiento de etiquetado de los péptidos son algunas de las ventajas de la peptidómica por afinidad.

 

Peptidómica combinatoria

La peptidómica combinatoria permite la determinación de la composición del peptidoma ensayando directamente los péptidos de digeridos trípticos crudos sin utilizar antibióticos o alguna otra selección cromatográfica o electroforética. Depende de las reactividades químicas de las cadenas laterales de aminoácidos y del contenido de aminoácidos en los péptidos, y no está basada en sus propiedades físicas. Las muestras de proteínas son proteolíticamente digeridas y las pozas de péptidos son agotadas o enriquecidas cuantitativamente por entrecruzamiento químico de un subjuego de péptidos a través de las cadenas laterales de aminoácidos a un soporte sólido, reduciendo la complejidad a un grado requerido para hacerla compatible con la detección por MS.

Como las proteínas, los péptidos no modificados contienen generalmente hasta 8 grupos reactivos, de los cuales 6 son cadenas laterales de aminoácidos químicamente reactivas, mientras que los otros 2 grupos reactivos son los grupos terminales amino (-NH2) y carboxilo (-COOH) o los grupos amino épsilon de lisina y cadenas laterales de ácido aspártico y ácido glutámico. Alguna de estas cadenas laterales de aminoácido químicamente reactivas pude potencialmente ser empleada para agotar o enriquecer una muestra de péptido, el cual las contiene, en una manera específica y completamente predecible con respecto al contenido de aminoácidos. Estos pueden ser utilizados para las manipulaciones independientes de la secuencia de aminoácidos y del contenido de aminoácidos, a través de etiquetado fluorescente químicamente radioactivo o isotópico.

En el método de agotamiento, se pueden utilizar filtros de aminoácido de una a 6 diferentes combinaciones, repetidamente, o hasta que la complejidad de aminoácido de los péptidos remanentes sea reducida al nivel óptimo. Los péptidos que no contienen un aminoácido que no es reconocido por alguno de los filtros de aminoácidos permanecen en la mezcla. La poza agotada con menor complejidad de aminoácidos permite el análisis directo por TOF-MS y TOF/TOF-MS. La tasa de agotamiento varía dependiendo en el número de filtros de aminoácido utilizados o en la longitud de los fragmentos de péptido, siendo los péptidos más largos los que tienen mayor posibilidad de ser entrecruzados. Los péptidos no digeridos por completo son fácilmente eliminados de las muestras debido a su mayor longitud, los cuales tienen mayor probabilidad de ser entrecruzados. Este método es directo, más rápido y más estable para péptidos de 10 aminoácidos o más largos.

En la técnica de selección por enriquecimiento, los péptidos que contienen los aminoácidos requeridos son retenidos. Las mezclas de péptidos pasan a través de filtros individuales de aminoácidos o a través de diferentes combinaciones de filtros de aminoácidos seleccionados, conteniendo los aminoácidos respectivos. El ensamble de filtros se leva para remover los péptidos libres y el entrecruzamiento químico es atacado a fin de liberar los péptidos unidos. El método es más apropiado para péptidos más cortos. Como la técnica de agotamiento, el procedimiento puede ser repetido utilizando  filtros individuales o múltiples combinaciones de filtros de aminoácidos.

 

Espectrometría de masa

La espectrometría de masa (MS, por sus siglas en inglés) es una de las técnicas analíticas más importantes dado que genera información en la estructura y masa del péptido y permite la detección sensible y precisa del contenido péptido total aun en mezclas complejas. Está diseñada para medir la relación m/z de iones así como el número de iones presentes en cada valor m/z. Cada pico en el espectro representa una molécula ionizada, en este caso un péptido, con la altura proporcionar a la abundancia del péptido. La complejidad de la mezcla de péptido debe reducirse antes de MS enriqueciendo la proteína de interés y mejorando el rango y sensibilidad del instrumento.

MALDI-TOF-MS en combinación con cromatografía líquida (LC, por sus siglas en inglés) fuera de línea e ionización de electroaspersión (ESI, por sus siglas en inglés)-TOF-MS combinada con nanoLC en línea se utilizan ampliamente en peptidómica. Se ha reportado un protocolo de una etapa para muestreo, extracción y almacenamiento para peptidómica, empleando MALDI-MS-ácido dihidrobenzoico, para la señalización de péptidos utilizando la glándula pituitaria de ratón como modelo, así como otros tejidos neuronales.

Las características clave de un espectrómetro de masa moderno son sensibilidad (femtomolar a attomolar), precisión de masa (altas a bajas ppm), resolución de masa (10,000 a millones) y velocidad de MS y MS/adquisición MS. MALDI y ESI son los métodos más populares y poderosos para producir iones en fase gas de proteínas y péptidos. Los analizadores, tales como los instrumentos de triple cuadrupolo (QqQ), se usan especialmente para experimentos de monitoreo de multirreacción dirigida (MRM, por sus siglas en inglés) para, por ejemplo, cuantificar simultáneamente docenas de proteínas/péptidos. Estos métodos pueden ser combinados con sistemas de tiempo de vuelo, tales como instrumentos Q-TOF y Q-trampa de ion (Q-IT, por sus siglas en inglés).

Los espectrómetros de masa de transformación Fourier y resonancia de ión en ciclotrón (FT-ICR, por sus siglas en inglés)  y el sistema más recientemente introducido orbitrap, representan el máximo nivel de MS en proteómica. Estos instrumentos ofrecen la más alta resolución (>100,000) y precisión de masa de bajo ppm, que permiten el análisis “de arriba hacia abajo” de proteínas intactas a diferencia del acercamiento “de abajo hacia arriba” empleado con más frecuencia. El acercamiento de arriba hacia abajo involucra la medición espectrométrica de masa de alta resolución y fragmentación de moléculas ionizadas intactas en la fase gas.

MALDI es muy popular porque es altamente sensible y forma iones cargados individualmente, lo que facilita el análisis de mezclas complejas. Debido a su naturaleza pulsante, MALDI es con frecuencia acoplado a un analizador de masa TOF. El peptidoma de una célula, un organelo o un órgano puede ser directamente analizado por MALDI-TOF-MS. En este método, una pequeña cantidad de muestra es premezclada en solución con un material absorbente de luz conocido como la matriz (ácido alfa-ciano-4-hidroxicinámico) y aplicado a la placa objetivo. Luego de secarse, la placa es insertada en la fuente de ionización en donde un pulso de luz ultravioleta es dirigido hacia la muestra. La ionización de la muestra resulta en moléculas cargadas individualmente.

MALDI-TOF-MS tiene muchas ventajas pues analiza las mezclas directamente, es menos susceptible a impurezas y sales, y también resulta en la formación de moléculas cargadas individualmente. Otros métodos de ionización como ESI resultan en estados cargados múltiples de péptidos más grandes, que interfieren en la interpretación de datos del espectro de masa. Los instrumentos MALDI-TOF equipados con fragmentación selectora de iones por decaimiento post-fuente (PSD, por sus siglas en inglés) ayudan a obtener información estructural. La mayor desventaja de PSD es la adquisición de espectro de muy larga duración y la baja resolución de los selectores de iones. Esto puede ser problemático cuando se trabaja con mezclas complejas como extractos de tejidos. Avances recientes en el desarrollo de instrumentos, tales como MALDI-Q-TOF, el cual combina las ventajas de la ionización MALDI y el análisis de MS tándem Q-TOF, proporcionan una excelente herramienta para el análisis de péptidos in situ.

La combinación de MS con técnicas de separación miniaturizadas, tales como nanoLC-ESI-TOF, resultan en herramientas poderosas. ESI puede ser acoplado con HPLC (en línea) dado que transfiere iones directamente desde la solución hacia la fase gas. La ventaja es que los péptidos son separados y enjuagados gradualmente mientras que cada péptido es marcadamente enfocado y concentrado en un pico cromatográfico. Luego los péptidos son analizados espectrométricamente a medida que son enjuagados de la columna. Mientras que un aspecto importante de ESI en favor de las proteínas es la producción de múltiples iones cargados, lo que ayuda a analizar proteínas con masas de hasta 100 kDa es una ventaja m/z pequeña, la fragmentación de múltiples iones cargados rinde fragmentos de iones más detectables.

El análisis de datos de MS requiere software sofisticado para obtener, almacenar, recuperar, procesar, validar e interpretar los datos y para eventualmente transformarlos en información biológica útil. Mientras que los programas de identificación y búsqueda de bases de datos de péptidos y proteínas como Mascot, Sequest y Phenyx han estado en uso exitoso por largo tiempo, se han construido infraestructuras de software totalmente nuevas para el procesamiento y validación de datos, tales como la arquitectura SBEAMS, que alberga los módulos Trans-Proteomic Pipelene y microarray que manejan datos de expresión tanto de genes como de proteínas/péptidos. Las bases de datos abiertas tales como PeptideAtlas se han establecido para convertir los datos en información accesible públicamente. La idea detrás de tales recursos es proporcionar al investigador los medios para valorar la calidad de los datos en una manera dependiente del juego de datos y controlar la compensación entre falsos positivos (especificidad) y falsos negativos (sensibilidad) en la base de evaluación estadística extensa. Además del progreso en el procesamiento de datos, las plataformas de software que permiten la entre-correlación con otras fuentes ómicas y apoyan la interpretación de rutas están en constante y rápido surgimiento y maduración. El éxito de la peptidómica dependerá en gran medida de la habilidad para convertir datos en información biológica apropiada.

 

Esquema de la información obtenida de la combinación de técnicas  HPLC–MALDI-TOF MS

 

 

Preparación de muestra para la peptidómica

Los procedimientos de operación estandarizados son necesarios para minimizar las variaciones debidas a manejo de la muestra. Órganos como el cerebro y fluidos como sangre y fluido cerebroespinal contienen una alta concentración de péptidos que requieren separación antes de la MS.  Algunos fluidos corporales y órganos contienen una concentración muy baja de péptidos, lo que requiere preconcentración de las muestras antes de ser sujetas al análisis por MS. La pérdida de péptidos durante el secado de la muestra, la cual es un importante paso en peptidómica, es motivo de preocupación. Se ha encontrado que aplicando n-nonil-β-D-glucopiranosido (C9-Glu) como aditivo junto con la selección del tipo apropiado de vial (polipropileno para liofilización y vidrio para evaporación centrífuga) puede evitar o disminuir la pérdida de péptido durante el procedimiento de evaporación.

La preparación de la muestra puede involucrar varias etapas.

 

Colección de la muestra y tratamiento preanalítico

Los métodos de selección, colección y preanalíticos son importantes para la peptidómica. Las muestras de tejido deben ser mantenidas intactas con función biológica preservada mediante rápida transferencia y preservación en nitrógeno líquido. La tecnología de arreglos (matrices o arrays) de tejido permite que las células sean depositadas en un chip de proteína o chip de array tisular con numerosas características seguidas por reconocimiento dirigido (target) por anticuerpos de más de un centenar de tipos. Las muestras de fluidos corporales pueden ser analizadas como sangre entera, plasma, suero, células mononucleares de sangre periférica y células tumorales en circulación utilizadas como tejido substituto.

Los ensayos inmunosorbentes ligados a enzimas, los ensayos enzimáticos, la citometría de flujo y el análisis de transcripto ayudan a detectar biomarcadores en fluidos. Los portadores deben ser separados de las proteínas abundantes, y las proteínas separadas de los péptidos. La identificación de modificaciones post-traduccionales y las variantes de división requiere técnicas analíticas especializadas y búsqueda sofisticada en bases de datos.

Las células cultivadas son útiles porque permiten mayor accesibilidad, control más sencillo de las variantes y condiciones experimentales, homogeneidad, uso de muchas herramientas y recursos de biología celular, obteniendo información bioquímica específica en puntos espaciales y temporales por microscopia confocal, reacción en cadena de polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) in vivo y otras técnicas de biología celular. Aunque una de las desventajas de utilizar células para estudios peptidómicos es la disponibilidad limitada de tipos cultivables de células, la ventaja de utilizar células es que pueden ser empleadas para evaluar una nueva técnica analítica e identificar variabilidad, reproducibilidad y sensibilidad de los métodos. Los datos pueden ser evaluados y los correspondientes células y tejidos pueden ser comparados.

La extracción de proteínas a partir de células cultivadas con clorhidrato de guanidinio, la interrupción mecánica de los bloques tisulares y la homogeneización de tejidos blandos resultan en rendimientos inconsistentes. El sistema de preparación de muestra por tecnología de ciclado a presión (PCT SPS, por sus siglas en inglés), un método de extracción más robusto y mejor controlado, se utiliza para liberar DNA, RNA y proteínas. Proporciona un acercamiento rápido, seguro y reproducible para procesar muchos tipos de biomuestras para PCR, RT-PCR, microarray, inmunorreacción, SDS-PAGE, western blotting y geles 2D. El uso de procesos controlados por instrumentos en tubos sellados de un solo uso facilita un alto nivel de seguridad y reproducibilidad operativa y está libre de contaminación cruzada. La extracción PCT SPS es una poderosa técnica para extraer una variedad de moléculas a partir de una amplia selección de muestras. Es un método suave que puede ser utilizado para extraer organelos subcelulares que retienen integridad estructural y funciones biológicas y hay menos corte de DNA. Las proteínas de alto peso molecular y las moléculas hidrofóbicas son extraídas más eficientemente. Es más reproducible que las técnicas convencionales de extracción.

 

Enriquecimiento y detección de proteínas útiles para los estudios peptidómicos

Los reactivos estandarizados de alta calidad son indispensables para la especificidad y reproducibilidad de los estudios peptidómicos. El objetivo (target) puede ser enriquecido a partir de mezclas complejas mediante captura de moléculas, tales como anticuerpos y aptámeros. La falta de estándares, reactivos y tecnologías validadas resulta en carencia de desarrollo, manejo, interpretación y comparación, alentando el progreso del descubrimiento a las aplicaciones clínicas. Los aptámeros son prometedores como adjuntos a los anticuerpos.

Los nuevos ensayos de microarreglo (microarray) ligadores de proteínas en estado sólido, basados en principios convencionales de inmunoensayo, han sido desarrollados utilizando una variedad de reactivos de captura inmovilizados para detectar proteínas y fragmentos de proteínas (péptidos) extraídos de muestras biológicas. Los reactivos de captura son inmovilizados en un soporte sólido como vidrio, membranas sintéticas, mini o nano esferas, y placas de espectrómetro de masa. Decenas de miles de características de captura pueden ser arregladas en una matriz dado que los elementos de microarray pueden ser miniaturizados, cada elemento seleccionado siendo específico para una proteína o péptido dado. Utilizando este formato, pueden ser conducidos múltiples ensayos de manera simultánea. La alta densidad de reactivos de captura permite un sistema de alto rendimiento para medir muchas proteínas y sus papeles en la red de interacciones bioquímicas y de señalización en una muestra. Las moléculas reportero pueden ser necesarias en la detección de la presencia de un target en una muestra biológica particular, y el reportero puede trabajar algunas veces modificando las moléculas target.

Se requieren materiales de referencia para la calibración de los instrumentos o para comparar diferentes tecnologías de plataforma proteómica. Las proteínas de membrana pueden ser importantes marcadores de diagnóstico y prognosis y constituyen hasta el 30% de las proteínas codificadas por genes, mientras que el 60% de los medicamentos y otras drogas actúan en las proteínas de membrana. Las proteínas de membrana son responsables y esenciales para los metabolismos celular y subcelular y por tanto es importante detectar sus estructuras. Son difíciles de obtener y cantidades suficientes. Es difícil imitar su ambiente y difíciles de cristalizar pues funcionan en asociación con otros componentes celulares, tales como organelos o complejos de proteínas. Las modificaciones post-traduccionales son importantes para su función.

Al combinar PCT SPS con la nueva química proporcionada por el conjunto ProteoSolveLRS, es posible fraccionar los componentes lípido y proteico de una muestra, resultando en una mayor recuperación de proteína y una mayor reproducibilidad, comparada con los métodos tradicionales de extracción basados en detergentes. Las proteínas sub-representadas en los extractos de métodos convencionales pueden ser extraídas exitosamente por el método PCT SPS/ProteoSolveLRS.

 

Separación de péptidos

Generalmente la tripsina es utilizada para digerir las proteínas en varios péptidos. La separación de los péptidos de proteínas mayores a 20 kDa es una etapa de preparación necesaria para reducir la carga de proteína para la cromatografía y la MS. La reducción subsecuente en la complejidad de las mezclas de péptidos por separación o concentración antes de MS puede ser necesaria para el óptimo análisis de péptidos. La separación de mezclas complejas disminuye la influencia negativa de los contaminantes, mejorando así la sensibilidad y la precisión, previniendo la ionización competitiva por las técnicas de detección como MALDI y ESI. La concentración del analito determina la eficiencia de ionización dado que los analitos concentrados son más sensibles a la detección.

El método preferido de separación de péptidos es la HPLC de fase inversa, especialmente una combinación de intercambio de iones con HPLC de fase inversa, lo que permite que los analitos permanezcan en la fase líquida. La recuperación de péptidos puede ser posible en una forma molecular sin cambio, dado que la mayoría de los péptidos no contienen estructuras secundarias y terciarias complejas. Las técnicas basadas en cromatografía han sido desarrolladas para la preseparación de proteína y péptido, conocida como tecnología multidimensional de identificación de proteína (MudPIT, por sus siglas en inglés), también llamada tecnología proteómica de escopeta o “shotgun”. El intercambio de iones seguido por fase invertida, esto es, cromatografía bidimensional, es acoplado con ESI-MS, en un enfoque basado en la digestión del “proteoma” en pasos previos del flujo de trabajo y separación a nivel de péptido.

Las proteínas más abundantes de la muestra compleja a escala de proteoma, pueden necesitar ser agotadas de una muestra por cromatografía por afinidad sin afectar la composición de péptido remanente, especialmente cuando se analiza el plasma humano. La tecnología ecualizadora consiste de una biblioteca combinatoria de ligandos unidos a esferas, lo que reduce las diferencias de concentración en plasma y orina humanas, esencialmente por ligar menos de las proteínas más abundantes y más de las proteínas raras. Una estrategia complementaria es enriquecer las proteínas de baja abundancia, por ejemplo, cuando se buscan sub-proteomas, tales como fosfoproteoma o glicoproteoma. Los limpiadores químicos, tales como la captura por afinidad con metal inmovilizado (IMAC, por sus siglas en inglés), las resinas de dióxido de titanio o las partículas de alúmina, son empleados para capturar fosfopéptidos y fosfoproteínas. Los péptidos glicosilados pueden ser enriquecidos por afinidad a lectina o por diferentes reacciones de atrapado, tales como química de hidracida. Se ha desarrollado un acercamiento llamado marcado-vía-sustrato (TAS, por sus siglas en inglés) para la identificación global de enriquecimiento O-glucosilo.

En combinación con MS, la electroforesis capilar permite la separación de péptidos que van desde moléculas pequeñas hasta proteínas grandes en el mismo análisis. Las ventajas de la electroforesis capilar son alta eficiencia, tiempos de análisis rápidos y bajo consumo de muestra y reactivo.

 

 

Identificación de péptidos

La identificación de péptidos basada en el poder separador de las técnicas cromatográficas conlleva problemas específicos. Las muestras biológicas usualmente tienen una concentración más elevada de proteínas más grandes, comparadas con los péptidos. Por ejemplo, en el plasma sanguíneo, el contenido de albúmina es más alto que el del contenido total de proteína (aproximadamente 40-50 gl/l), lo que corresponde a casi 1 mmol/l en concentración molecular. Sin embargo, las concentraciones típicas de péptidos en la sangra varían entre concentración micromolar y picomolar para las hormonas peptídicas.

Los ensayos MRM están establecidos para la cuantificación de marcadores de proteínas basados en candidato, en plasma. Es el estándar de oro para la identificación y cuantificación de moléculas de drogas (incluidos medicamentos) y metabolitos en muestras de plasma clínicamente relevantes, debido a su extremadamente  alta sensibilidad y especificidad. Para la proteómica clínica, es utilizado un método involucrando el fraccionamiento cromatográfico de péptidos por fuerte intercambio de cationes y enriquecimiento por inmunoafinidad en anticuerpos antipéptido específicos (estándares por isotopo estable y captura por anticuerpos antipéptido o SISCAPA, por sus siglas en inglés). Combinado con cuantificación de MRM por MS, SISCAPA genera la cuantificación confiable y reproducible de péptidos firma para los digestos de proteína.

Otros métodos para el fraccionamiento de la muestra son el uso de esferas magnéticas para la captura de péptidos, permitiendo una mayor relación área superficial-a-volumen que los diseños de chip de proteína de placa plana; la inmunoafinidad de alto rendimiento combinada por la instrumentación MS y los métodos de biofabricación para la integración y comparación de datos proteómicos desde diferentes plataformas; la plataforma de microarreglo empleando análisis interferométrico que ofrece el potencial de alto rendimiento libre de etiqueta y análisis sensible de pequeñas cantidades de fluidos biológicos, llevando a la identificación de reactivos de anticuerpo útiles y arrays de anticuerpo apropiados para el descubrimiento y proteómica clínica; despliegue de fagos in vitro para identificar ligandos péptidos de alta afinidad; y evaluación de métodos para monitorear el grado de degradación de muestras biológicas en bancos.

Dos diferentes procedimientos de ionización que permiten la transferencia de péptido al analizador de masa, son empleados en MS. ESI-MS es el método de preferencia para el análisis de fragmentos trípticos por combinación de LC y MS. Este método es complicado cuando hay péptidos más grandes en las muestras. En este caso, las mezclas complejas se resuelven mejor con sensibilidad elevada empleando tecnología MALDI-MS, dado que resulta en moléculas cargadas individualmente y con menos frecuencia en moléculas doblemente cargadas. Se ha introducido el concepto de atrapado de péptido en el cual el análisis d péptido es realizado utilizando MS con determinación de secuencia de todos los péptidos detectados. Utilizando el atrapado de péptidos se han realizado análisis a gran escala de péptidos en la sangre humana, y se ha creado un banco de péptido de más de 100,000 litros de ultrafiltrado sanguíneo.

Representación esquemática de un instrumento de desorción laser asistida por matriz-tiempo de vuelo-espectrometría de masa (MALDI-TOF-MS), Los iones son acelerados por un campo electrostático que se aplica en los platos de aceleración (Acc),y guiados a través de los deflectores (Df) antes de entrar al “campo libre” de vuelo

 

La secuencia aminoácida de péptidos, especialmente péptidos de hasta 9 kDa, es identificada con un acercamiento arriba-abajo. Sin embargo, la identificación de péptidos con la misma composición de aminoácidos pero con diferentes secuencias, es limitada, pues estos péptidos tienen los mismos pesos moleculares y generan el mismo espectro MS de iones moleculares. Aquí, CE y LC acopladas con MS es deseable. Utilizando 2 tripéptidos, Gly-Ser-Phe y Gly-Phe-Ser, para separación por CE, se ha demostrado que se logra una excelente selectividad de separación. CE permite eficiencias de separación hasta de varios millones de placas por metro debido a una eficiente disipación de calor del capilar de diámetro pequeño y el elevado campo eléctrico. Adicionalmente, el rápido tiempo de análisis, el bajo consumo de muestra y reactivo, y la versatilidad, lo hacen una poderosa alternativa  a HPLC. También se utilizan métodos CE/CEC-ESE-MS para el análisis. El acercamiento arriba-abajo ha sido aplicado exitosamente para la identificación de péptidos endógenos en el fluido cerebroespinal y en el tejido cerebral murino.

 

Cuantificación de péptidos

Las muestras son primero etiquetadas con uno de los dos químicos relacionados que difieren isotópicamente. En estudios peptidómicos cuantitativos, un tema importante es una comparación precisa del nivel cuantitativo de los péptidos de interés entre 2 muestras. Cuando se realizan separaciones de péptidos por HPLC (LC-MS) el método más sencillo para comparar las abundancias relativas de péptidos es a través del uso de un detector UV colocado entre el sistema LC y el espectrómetro de masa. Sin embargo, la menor reproducibilidad del área/altura del pico asociado con las señales MS es una desventaja importante para la comparación de niveles de péptidos. No obstante, para compuestos que poseen masa y grupos funcionales similares, las intensidades relativas de ión pueden corresponder a sus contenidos relativos.

La cuantificación directa por MS es realizada empleando estándares internos. Un estándar interno es con frecuencia a copia de la molécula que contiene uno o más isótopos pesados estables. La adición de concentraciones conocidas del estándar interno a la muestra biológica puede ser utilizada para obtener una cuantificación precisa. Sin embargo, en estudios de peptidómica, un gran número de péptidos es detectado en un solo análisis. La cuantificación directa de cada péptido presente en el tejido sería muy laboriosa y costosa. En su lugar, es más fácil examinar el nivel relativo de un péptido en 2 muestras diferentes.

La cuantificación absoluta de péptidos fue descrita empleando el acercamiento clásico de estándar interno etiquetado con isótopo. El concepto de péptidos prototípicos toma esta estrategia a nivel de proteoma por selección del mejor péptido volador para proteína como un identificador único. Recientemente, la cuantificación directa de más de 50 proteínas plasmáticas fue demostrada con este acercamiento. El diseño y producción de dichos péptidos de referencia etiquetados con isótopo requiere mejoras adicionales para una explotación óptima.

La cuantificación relativa de péptidos puede ser alcanzada mediante la incorporación de isótopos estables en los péptidos en una manera diferencial (isótopo pesado versus ligero) seguido por comparación espectrométrica de masa de las señales derivadas de la muestra etiquetada con isótopo pesado y ligero. Este método ha sido valorado en escenarios reales. Las etiquetas isotópicas pueden ser incorporadas en los péptidos luego de su extracción. Cada una de las 2 muestras de péptidos para ser comparadas es etiquetada con una de las 2 formas isotópicas de un reactivo dado (por ejemplo, una muestra puede ser etiquetada con una forma H-isotópica de un reactivo dado, tal como el H6-anhídrido acético, H6-Ac20, y la otra con su forma deuterizada D6-anhídrido acético, D6-Ac20). Ambas muestras son mezcladas y sujetas a análisis micro HPLC-MS o nano HPLC-MS. La intensidad relativa de las señales MS de las formas pesada y ligera de los péptidos etiquetados revela sus cantidades relativas en ambas muestras biológicas. Estas técnicas con etiquetado isotópico no proporciona una cuantificación absoluta de los péptidos, y en su lugar proporciona solamente una medición de los cambios relativos en los niveles de péptidos entre 2 muestras.

En otro acercamiento, si se trabaja con un sistema de cultivo celular o con un organismo, la dieta conteniendo el isótopo enriquecido puede ser administrada y la etiqueta puede ser incorporada en el péptido durante su biosíntesis. Este acercamiento ha sido utilizado para el análisis de la tasa de biosíntesis de péptido en líneas celulares neuroendocrinas. En este método, la abundancia relativa del péptido en las 2 muestras puede ser calculada de la relación de la intensidad de pico o área de pico de las 2 formas isotópicas. La introducción de las etiquetas de masa puede ser también lograrse por etiquetado metabólico, lo cual es ventajoso por su mínima interferencia con el sistema biológico. El etiquetado metabólico es realizado rutinariamente con células cultivadas que van de bacterias y levaduras a células de mamífero. Esto ha sido demostrado en organismos multicelulares, tales como Caenorhabditis elegans, D. melanogaster y ratas.

Los métodos químicos o enzimáticos deben ser aplicados para etiquetar tejidos o fluidos recuperados ex vivo. El concepto de etiqueta química fue introducido bajo el nombre de etiqueta de afinidad codificada por isótopo (ICAT, por sus siglas en inglés). El método de etiquetas de isótopo para la cuantificación relativa y absoluta (iTRAQ, por sus siglas en inglés) ofrece análisis cuádruplex, en el que 4 condiciones pueden ser comparadas en un experimento. En vista de métodos de etiquetado químico múltiple, típicamente realizados por post-digestión y dirigidos a una cadena lateral de aminoácido a la vez, se introdujo un nuevo concepto denominado etiquetado por anilina-ácido benzoico (AniBAL, por sus siglas en inglés) en donde la misma etiqueta es introducida en todas las funciones amino y carboxilo a nivel de proteína. Este acercamiento minimiza la subjetividad de la muestra, optimiza el cubrimiento del proteoma y está basado en química simple y simétrica. Se ha extendido el concepto de isótopo estable a la glicómica cuantitativa mediante el desarrollo de un esquema de derivación cuádruplex favorable a la lectura espectral de masa.  Acercamientos libres de etiqueta han sido desarrollados más recientemente, en base a condiciones LC-MS altamente reproducibles, lo que permite el análisis comparativo de péptidos en muestras complejas.

ICATs que reconocen el grupo sulfhidrilo de la cisteína han sido empleados en estudios peptidómicos. Los péptidos que son extraídos de 2 grupos de animales son etiquetados con una forma pesada o ligera de un reactivo ICAT. Luego de la digestión enzimática, los péptidos etiquetados de las 2 muestras combinadas son purificados por cromatografía de afinidad, y luego los péptidos son identificados por análisis LC-MS/MS. En ambas condiciones, la abundancia relativa de los péptidos puede ser comparada al analizar sus intensidades relativas de señal. Sin embargo, muy pocos péptidos contienen residuos de cisteína y por lo tanto la tecnología ICAT puede ser empleada solamente para los péptidos que contienen dicho aminoácido.

Para evitar dichos métodos de etiquetado general, se han introducido otros reactivos que reaccionan con aminas. Las etiquetas isotópicas mejor descritas para peptidómica son los ésteres activos de butirato de trimetilamonio (TMAB, por sus siglas en inglés) conteniendo 9, 6 y 3 deuterios (pesado) o una forma ligera sin deuterio, lo que permite el análisis multivariado en un solo análisis LC/MS, con cada péptido etiquetado isotópicamente difiriendo en masa por 3 Da por etiqueta incorporada. El éster de N-hidroxisuccinimida del reactivo TMAB reacciona con las aminas presentes en el término N del péptido y/o en la cadena lateral de los residuos de lisina. Con este método peptidómico cuantitativo es posible detectar, cuantificar e identificar aproximadamente 100 péptidos en extractos de un hipotálamo de ratón. Adicionalmente, un gran número de péptidos son también detectados en otras regiones cerebrales tales como la corteza prefrontal, el striatum, el hipocampo y la amígdala. Sin embargo, la desventaja de este método es que el reactivo TMAB muestra inestabilidad de los péptidos etiquetados en algunos análisis MS, dependiendo de las condiciones experimentales.

Utilizando un acercamiento de peptidómica cuantitativa, se han realizado varios estudios, algunos de los cuales son relevantes para el área de ingestión de alimento y/o regulación del peso corporal, los cuales involucran ratones que carecen de enzimas procesadoras de péptidos. En base al análisis peptidómico cuantitativo, se ha demostrado que el incremento de peso corporal en los ratones Cpefat/fat es debido a los niveles reducidos de péptidos que disminuyen el peso corporal, tales como la hormona estimuladora de α-melanocito.

 

Modificaciones post-traduccionales

Los eventos de procesamiento covalente que cambian las propiedades de un péptido por división o adición de uno o más aminoácidos son llamados modificaciones post-traduccionales (posttranslational modifications o PTMs, por sus siglas en inglés), y la mayoría de los péptidos requieren una modificación para volverse funcionalmente activos o para mejorar su estabilidad. El las enzimas de procesamiento comúnmente involucradas son endopeptidasas. Además de la división por peptidasa, otras enzimas realizan adicionalmente acetilación, fosforilación, amidación de terminal C y sulfatación. Un importante PTM protector en los péptidos es la amidación, la cual es realizada por peptidil-α amidante monooxigenasa, una enzima multifuncional que realiza un proceso de 2 etapas de conversión de residuos de glicina C-terminal en un grupo amida.

La mayoría de los neuropéptidos portan un ácido piroglutámico en su término N, el cual es formado por la ciclación de una glutamina N-terminal. Algunos péptidos, como melanotropinas y β-endorfinas, son acetiladas en su término N para incrementar su estabilidad y para modular su actividad. Los péptidos no son siempre procesados de la misma manera en diferentes tipos de células o aún dentro del mismo tipo de célula bajo diferentes condiciones. Esto se debe a que diferentes tipos de péptidos con frecuencia se unen a sus objetivos receptores con diferentes afinidades. El procesamiento post-traduccional puede servir para regular las propiedades bioactivas resultantes del péptido. Un importante ejemplo es el procesamiento de proopiomelanocortina en la hormona adrenocorticotrópica en la pituitaria anterior y en hormona estimulante de α-melanocito en la pituitaria intermedia.

Usualmente, las PTMs pueden ser identificadas por comparación de datos experimentales a una secuencia conocida de aminoácidos, pero esto requiere la detección previa de la secuencia péptida antes del análisis de PTM. En el caso de modificaciones lábiles, tales como sulfatación y glicosilación, las modificaciones pueden perderse antes de la fragmentación del péptido. En esta condición, el péptido puede ser secuenciado y la PTM identificada, pero el incremento de masa entre la secuencia obtenida y la masa madre será la misma que la de la PTM. Por tanto, en esta condición la localización exacta de la PTM no puede ser identificada. Si la modificación es estable, tales como acetilación, metilación, oxidación, amidación N-terminal o formación de ácido piroglutámico, el espectro de fragmentación será similar al del péptido modificado. Existe una excepción para los aminoácidos modificados, los cuales tendrán un incremento o decremento de masa correspondiente a la PTM. En esta condición, el patrón de fragmentación permitirá la localización exacta de la modificación.

 

Validación del método

Muchos factores complican los datos, tales como edad, género, constitución genérica, raza, comportamiento, hábitos, actividades físicas, ingestión de alimentos/nutrimentos, mutaciones causadas ambientalmente y modificaciones. Los datos son más o menos determinados al tiempo de la colección de la muestra, por lo que la misma es de suma importancia. La validación tecnológica, clínica y biológica es indispensable.

Las validaciones tecnológicas son estudios rigurosos que demuestran la reproducibilidad, precisión y sensibilidad de los métodos de procesamiento. Los datos deben tener un coeficiente de variación pequeño (< 5%) y una desviación estándar pequeña (> 0.95), cubriendo un rango dinámico grande de 3-4 registros, lo cual será un reto dados los hechos de que el número y tipo de proteínas en una muestra pueden ser tremendos; por ejemplo, las proteínas séricas de los tipos altamente abundantes y poco abundantes pueden estar en el rango mayor a 10 mil millones de veces, con variaciones en la recuperación de las proteínas altas y bajas por un método específico.

La validación clínica es igualmente un reto y se requiere para el diagnóstico y terapéutica. Los  métodos validados y estandarizados son críticos y deben ser realizados en una forma organizada y colaboradora.

Los métodos peptidómicos están avanzando, posiblemente  con bajos costos, mejores resultados, información nueva, y mejor salud pública con mejor terapéutica y alimentos naturales a futuro. La mayoría de la información de secuencia es generada a través de métodos de espectrometría de masa, seguida por comparación de bases de datos debido a la naturaleza de alto rendimiento de la técnica.

 

Aplicaciones de la peptidómica

La peptidómica ofrece varias aplicaciones, algunas se las cuales se introducen a continuación:

 

Péptidos como biomarcadores

Un biomarcador puede definirse como una molécula que puede ser medida y evaluada como un indicador de procesos biológicos normales, procesos patológicos o respuestas farmacológicas a la terapéutica. Los péptidos sirven como biomarcadores ideales dado que tienen la habilidad para dar cuenta de todas o casi todas las variaciones del estado fisiológico del individuo. Los péptidos aparecen en todos los fluidos corporales (sangre, plasma, orina o fluido cerebroespinal) y poseen la capacidad para migrar entre compartimientos de un organismo.

Se ha elucidado el potencial de los péptidos como marcadores para inhibición de proteasa in vivo, analizando muestras de plasma de animales tratados con el inhibidor indirecto de FXa FONDAPARINUX o el inhibidor de dipeptidilpeptidasa IV, AB192. Se ha demostrado que los péptidos regulados son substratos, productos u objetivos (targets) corriente debajo de la proteasa inhibida, sugiriendo que el análisis in vivo de péptidos mediante la peptidómica tiene el potencial para ampliar el conocimiento de efectos relacionados al inhibidor in vivo y que este método puede preparar el camino para el desarrollo de biomarcadores predictores.

Una metodología sistemática para la identificación, en todo el proteoma, de péptidos inhibiendo la proliferación y migración de células endoteliales, desarrollada en el año 2008 proporciona una guía para un acercamiento peptidómico de base computacional para el descubrimiento de péptidos bioactivos endógenos.

Se han establecido o adaptado las plataformas proteómicas de última generación para utilizar orina como fuente de muestra para el descubrimiento de biomarcadores. El rápido método en una etapa de CE-MS permite la resolución del proteoma urinario de pequeño peso molecular en un modo de alto rendimiento. El análisis peptidómico reproducible de alto rendimiento de péptidos de orina es con frecuencia obstaculizado por la variabilidad inherente en factores, tales como pH y concentración de sales. Se ha desarrollado un método rápido y robusto, generalmente aplicable, para el estudio de grandes números de muestras de orina, resultando en un amplio espectro de péptidos nativos, como una herramienta para ser utilizada en el descubrimiento de biomarcadores. Las muestras de péptidos fueron atrapadas, desaladas, su pH normalizado y fraccionadas en un sistema miniaturizado automático de cartucho de intercambio fuerte de catión en fase inversa (RP-SCX, por sus siglas en inglés). Los péptidos enjuagados fueron analizados por MALDI-TOF, resonancia de iones por ciclotrón Fourier, y LC-trampa de iones MS. Unas pocas muestras seleccionadas de orina de individuos infectados por Schistosoma haematobium, fueron elegidas para evaluar la aplicabilidad clínica. El sistema RP-SCX de limpieza y fraccionado de muestra exhibe una elevada reproducibilidad cualitativa y cuantitativa tanto con estándar BSA y orina. Debido a la relativamente alta capacidad de unión al cartucho, los péptidos enjuagados pueden ser medidos con elevada sensibilidad utilizando MS múltiple.

 

Biomarcadores péptidos en la enfermedad

La peptidómica ayuda en la detección temprana, caracterización y diagnosis de muchas enfermedades tales como la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer y el cáncer, y es crucial para el control y prevención de las enfermedades. Las células cancerosas exhiben cambios específicos en la expresión de proteínas y alteración en las actividades proteolíticas; a su vez, los péptidos son capaces de reflejar estos cambios patológicos. La calcitonina, un marcador péptido de tumor, de 3.5 kDa, es expresada primariamente por las células C (células parafoliculares o ultimobranquiales de la tiroides), mientras que la calcitonina en suero es un marcador sensible y preciso del carcinoma medular de tiroides.

El estudio de amplio espectro de los complementos proteínicos o péptidos celulares durante la patogénesis cardiovascular, es favorecido por las tecnologías de la peptidómica y la proteómica. La identificación de proteína MALDI-TOF con LC/MS/MS (HPLC-tándem MS), 2DGE, GeLC/MS/MS (digestión tríptica de proteínas fraccionadas por SDS-PAGE e identificadas pro LC/MS/MS) han sido empleados para identificar biomarcadores para el diagnóstico y estratificación de riesgo de quistes pancreáticos. El último acercamiento, que requiere menos de 40 ml de fluido del quiste por muestra, ofrece la posibilidad de analizar quistes menores a 1 cm de diámetro, revelando un panel de proteínas biomarcadores potenciales para facilitar el futuro diagnóstico y estratificación de riesgo de quistes pancreáticos, que se correlacionan con el antígeno carcinoembriónico (CEA, por sus siglas en inglés). Los biomarcadores son 2 homólogos de amilasa, moléculas solubilizadas de 4 mucinas, cuatro moléculas solubilizadas de adhesión celular relacionadas a CEA (CEACAMs, por sus siglas en inglés) y 4 homólogos S100.

Los neuropéptidos toman parte en la mediación de la falla del sistema nervioso central asociado con la enfermedad de Parkinson. La principal patología causante de la enfermedad de Parkinson es la degeneración progresiva de neuronas dopaminérgicas (neuronas cuyo neurotransmisor primario es la dopamina) en la substantia nigra pars compacta, proyectando hacia el striatum en el cerebro. Una técnica de preparación de muestra cuidadosamente controlada, junto con un acercamiento peptidómico y colecciones de secuencia de neuropéptidos dirigida, permite la detección sensible, identificación y cuantificación relativa de varios neuropéptidos endógenos. Alteraciones en los niveles de neuropéptidos, previamente no reconocidas, han sido identificadas en ratones con lesión unilateral con/sin administración subcrónica de L-DOPA, el tratamiento convencional para la enfermedad de Parkinson. Varios de estos péptidos se originaron del mismo precursor, como secretogranin-1. La biotransformación relacionada a la enfermedad de precursores en péptidos individuales se ha observado en el modelo experimental de la enfermedad de Parkinson. Varios péptidos potencialmente biológicamente activos, no reportados previamente, fueron también identificados de las muestras de striatum. Existe una necesidad para  buscar biomarcadores que son indicadores de enfermedades neurodegenerativas, pues el diagnóstico clínico de las mismas es todavía poco satisfactorio. MS ha sido utilizada para estudiar las identidades, estructuras, modificaciones e interacciones de péptidos, que colectivamente rigen sus funciones biológicas. Las herramientas de la peptidómica están siendo utilizadas extensamente para encontrar biomarcadores CSF para las enfermedades neurodegenerativas. La tecnología proteómica basada en MS es apropiada para el descubrimiento de biomarcadores. Utilizando peptidómica cuantitativa, se ha demostrado que la carboxipeptidasa E contribuye a la producción de una mayoría de neuropéptidos.

 

Péptidos y asociaciones dieta-enfermedad

La peptidómica ayuda a entender las relaciones alimento-salud. El conocimiento ganado mediante el estudio de la relación alimento-salud ayudará a proporcionar una guía referente a la dieta balanceada y a aprender más sobre las enfermedades. La peptidómica ayuda a identificar biomarcadores a través de cambios en los péptidos inducidos por la dieta, para permitir un entendimiento más profundo del papel de los componentes alimentarios a nivel celular y nivel molecular, así como para estudiar los mecanismos de las asociaciones dieta-enfermedad.

 

Péptidos en la regulación del comportamiento

Combinando un método peptidómico cuantitativo recientemente establecido con paradigmas conductuales obligados en abejas, se ha elucidado la función de péptidos cerebrales bioactivos en la regulación del comportamiento. Utilizando etiquetado por isótopo diferencial, combinado con análisis de MS para cuantificar el 50% de los péptidos cerebrales de abeja conocidos en el contexto de forrajeo, se han encontrado 8 péptidos que muestran regulación robusta y dinámica. Otras observaciones fueron que algunos péptidos cerebrales de abeja muestran rápidos cambios en abundancia como una función de la experiencia en la recolección de néctar y polen para el almacenamiento más que para la ingestión, predisposición de algunas abejas para colectar néctar o polen, pero no ambos, y cambios de abundancia más fuertes de péptidos taquicinina, PBAN y sNPF en asociación con el forrajeo de néctar y polen, siendo estos péptidos conocidos por estar involucrados en la regulación de la ingestión de alimento en los insectos solitarios, lo que sugiere una conexión evolutiva entre la ingestión de alimento en los insectos solitarios y el forrajeo social en abejas.

Los péptidos cerebrales juegan un importante papel en la orquestación de los procesos fisiológicos y conductuales en animales, funcionando como neurohormonas, neuromoduladores y neurotransmisores en la señalización celular. Estas moléculas son producidas a partir de sus correspondientes genes precursores por separación en sitios específicos seguida por modificaciones post-traduccionales, un proceso complejo que puede hacer que los péptidos bioactivos sean difíciles de predecir. El secuenciado del genoma de la abeja mielera llevó a un nuevo acercamiento de alto rendimiento para el descubrimiento de neuropéptidos; los algoritmos que predicen los sitios de separación en los precursores de péptidos seguidos de secuenciación de muestras cerebrales con espectrometría de masa, ha llevado a la predicción de 36 genes codificadores de péptidos y la confirmación de 100 péptidos endógenos en el cerebro de la abeja, números similares a aquellos en la mosca de la fruta y en el ratón casero. Recientes avances en la peptidómica han acelerado en gran medida la caracterización de péptidos. Sin embargo, los acercamientos de alto rendimiento para descubrir la función de los péptidos han sido mucho menos comunes.

Esquema del flujo de trabajo entre la Proteómica, Peptidómica y la técnica de MALDI MS, la cual permite el mapeo simultáneo de péptidos y proteínas cortas en pequeñas secciones de tejido

 

 

Peptidómica y péptidos novel

El mapeado del contenido péptido de Caenorhabditis elegans y C. briggsae por LC-MALDI-TOF MS ha permitido una mejor anotación de los genes codificadores de neuropéptidos para el genoma de C. briggsae y proporciona una base prometedora para comparaciones evolutivas adicionales.

MALDI-TOF y el secuenciado de novo han sido utilizados para identificar los péptidos del veneno de Tityus serrulatus. Veintiocho péptidos fueron identificados como fragmentos de proteínas Pape; 10 correspondieron a fragmentos de la terminal N de la toxina TsK-β, algunos fueron fragmentos de toxinas del canal de potasio, y péptidos novel sin similitudes de secuencia con moléculas conocidas también fueron identificados.

Integrando los estudios sistemáticos de peptidoma y transcriptoma de la secreción dérmica defensiva de la rana arborícola de ojo rojo centroamericana, Agalychnis callidryas, se ha identificado a miembros nivel de 3 familias de péptidos antimicrobianas descritas previamente, un péptido relacionado a adenorregulina de 33-mer y un péptido relacionado a cerina de 27-mer. Un estudio reciente revela la posibilidad de un sistema antioxidante dérmico novel para la piel de Rana pleuraden, consistiendo de un número de péptidos pertenecientes a 11 grupos y algunos de ellos presentando propiedades multifuncionales, tales como actividades antioxidantes, antiinflamatorias y antimicrobianas combinadas.

Se ha aplicado la técnica de despliegue de fago in vitro para identificar ligandos péptidos de alta afinidad a membranas expresando acuaporina-2 y los análisis de biblioteca identificaron proteínas que poseen motivos estructurales homólogos.

Los péptidos biomarcadores comunmente se analizan por MALDI-TOFSubir

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2 comentarios

  1. Claudio Raul Bernal BUstos

    Cordial saludo, es un aporte importante en el tema de los biomarcadores, Tengo entendido que la peptidomica se hace sobre fluidos corporales, por ejmplo plasma, suero, etc, ¿es posible hacer con muestras de saliva, por ejemplo para observar cambios en factores asociados a metabolismos específicos?

    30/01/2012 en 16:41

    • StaffNP

      Hola Claudio Raul,

      Efectivamente, es posible aplicar técnicas de proteómica/peptidómica en saliva, que contiene más de 2 mil péptidos (50% de las proteínas secretadas), de los cuales más de la mitad proceden de fuentes diferentes a las glandulas salivales y que actualmente se emplean para el diagnóstico de cáncer, medición del nivel de intensidad del ejercicio y muchas otras cosas, con la enorme ventaja de ser de facil acceso. Te recomiendo que revises el artículo ‘Salivary Peptidomics’, de Amado et al, en Expert Review of Proteomics, October 2010, Vol. 7, No. 5: 709-721. Es una revision excelente que podrá ampliarte el tema.

      Saludos.

      31/01/2012 en 09:27